制备和表征AAV8-RBD疫苗
构建表达SARS-CoV-2刺突蛋白三聚体RBD的重组AAV8载体，并验证其抗原表达能力。
通过三重质粒转染AAV293细胞生产AAV8-RBD，纯化后使用TEM表征形态，Western blot检测HEK293T细胞中抗原表达。
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微针递送的腺相关病毒疫苗通过提高抗原呈递细胞感染增强抗病毒免疫
Microneedle-delivered adeno-associated virus vaccine amplified anti-viral immunity by improving antigen-presenting cells infection
实验完整度
高包含体外细胞实验、体内小鼠模型、流式细胞术、ELISA、ELISPOT、假病毒中和实验等多种实验，进行了机制验证和功能验证。
主要模型
BALB/c小鼠 B16F10细胞 HEK293T细胞 DC2.4细胞 RAW264.7细胞 HACAT细胞 HDF-a细胞 HSF细胞
重点核对
微针制备条件（20%海藻糖保护剂，4°C低温两步干燥） AAV8-RBD在微针中的生物活性（100%保留） 接种剂量（1×10^11 vg）和途径（背部皮肤） APC感染效率（流式分析皮肤和淋巴结中DC、LC、巨噬细胞的eGFP阳性率） 免疫应答评估时间点（第14天、第180天）
摘要
腺相关病毒（AAV）因其优异的生物安全性和高效的抗原基因递送能力，作为疫苗载体具有巨大潜力。然而，大多数AAV疫苗在肌肉注射后转导抗原呈递细胞（APC）的能力有限，可能因转导其他组织或细胞而导致细胞免疫应答不足和不期望的副作用。在此，我们开发了一种可溶性微针贴片，用于将AAV疫苗靶向表皮和真皮APC。为保持AAV疫苗的生物活性，通过优化的两步低温策略并使用20%海藻糖作为保护剂制备微针。表达SARS-CoV-2刺突蛋白三聚体受体结合域（RBD）的AAV血清型8（AAV8-RBD）在装载到微针（MN-A8R）后保持100%的生物活性。单次接种于小鼠背部皮肤后，MN-A8R有效招募APC至接种部位，并提高AAV8-RBD在APC中的感染。此外，MN-A8R促进了引流淋巴结中生发中心的形成增加。与皮下针头介导的皮内注射相比，MN-A8R诱导显著更强的细胞免疫应答和持久、高质量的 neutralizing 抗体。重要的是，MN-A8R对三种常见SARS-CoV-2假病毒至少六个月表现出更全面和稳健的交叉保护。我们的研究结果强调了使用优化的聚合物微针保持AAV疫苗生物活性并通过上调APC感染增强AAV疫苗效力的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 开发一种可溶性微针递送AAV疫苗，通过增强抗原呈递细胞的感染来提高抗病毒免疫应答的效果。
- 核心机制
- 微针递送的AAV疫苗通过招募APC至接种部位并提高AAV对APC的感染效率，从而增强APC的抗原呈递和共刺激分子表达，促进T细胞活化和生发中心形成，进而诱导更强的体液和细胞免疫应答。
- 主要证据
- 动物实验表明，MN-A8R相比ID-A8R显著提高皮肤和淋巴结中APC的感染比例，增强DC成熟和T细胞活化，诱导更高的生发中心B细胞、Tfh细胞、效应记忆T细胞和中和抗体滴度。
- 研究意义
- 该研究提供了一种高效、低痛、易储存的AAV疫苗递送平台，具有临床转化潜力，可应对未来大规模疫情。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
制备和优化AAV载药微针
开发可溶性微针递送AAV，并优化制备配方以保持病毒活性。
使用HA基质和20%海藻糖作为保护剂，通过两步低温法制备AAV8-GFP微针（MN-A8G）和AAV8-RBD微针（MN-A8R），表征其形态、机械强度、皮肤穿刺能力和转染效率。
评估微针递送AAV的体内转基因表达动力学
检测MN-A8L在皮肤中的转基因表达持续时间。
将MN-A8L应用于BALB/c小鼠背部皮肤，于不同时间点（3,7,14,30,60,120,180,240天）使用活体成像监测荧光强度。
评估微针递送AAV疫苗对APC感染效率的影响
比较微针和皮内注射对皮肤和淋巴结中APC感染效率的影响。
小鼠接种MN-A8G或ID-A8G，第14天取皮肤和腹股沟淋巴结，制备单细胞悬液，流式检测DC、LC、巨噬细胞中eGFP阳性比例。
评估体内DC成熟和T细胞活化
检测微针递送AAV疫苗对淋巴结中DC成熟和T细胞活化的影响。
接种MN-A8R或ID-A8R，第14天取腹股沟淋巴结，流式检测CD40和CD80表达（DC成熟）以及CD69表达（T细胞活化）。
评估体液免疫应答（抗体滴度）
检测MN-A8R诱导的RBD特异性抗体水平。
小鼠接种MN-A8R或ID-A8R，于第15,30,60,120,180天采血，ELISA检测WT-RBD和Omicron-RBD特异性IgG、IgG1、IgG2a滴度。
评估细胞免疫应答
评估MN-A8R诱导的T细胞应答和记忆细胞形成。
第180天取小鼠脾脏和腹股沟淋巴结，流式检测Tfh、GC B细胞、IFN-γ分泌CD4/CD8 T细胞、记忆T/B细胞；ELISPOT检测IL-4、IL-2、IFN-γ分泌细胞；ELISA检测细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-17A）水平。
评估假病毒中和抗体
检测MN-A8R诱导的中和抗体对多种假病毒的交叉保护作用。
第180天收集血清，与WT、Lambda、Delta假病毒孵育，加入ACE2-293T细胞，检测IC50值。
安全性评估
评估MN-A8R的局部和全身毒性。
第180天处死小鼠，采集全血进行血常规检测，采集主要器官（肝、心、肺、脾、肾、皮肤）进行H&E染色。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 材料与试剂 | 透明质酸 | Bloomage Biotechnology | -- |
| SYLGARD™ 184硅酮弹性体 | DOWSIL | -- | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG | Abcam | -- | |
| 小鼠IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-17A ELISA试剂盒 | eBioscience | -- | |
| 所有针对细胞表面标记的抗体 | eBioscience | -- | |
| 小鼠IL-4、IL-2和IFN-γ ELISPOT试剂盒 | Mabtech | -- | |
| SARS-CoV-2刺突RBD重组蛋白 | Sino Biological | 40592-V08H | |
| AAV生产 | FectoVIR转染试剂 | -- | -- |
| 苯并尼酶 | -- | -- | |
| POROS™ CaptureSelect™ AAVX亲和树脂 | Thermo | A36745 | |
| Amicon® Ultra-15超滤管 | Merck | -- | |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | ISEQ00010 |
| 抗SARS-CoV-2刺突小鼠单克隆抗体 | Sino Biological | 40591-MM42 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG | Thermo | 31431 | |
| ECL底物试剂 | Millipore | WBKLS0100 | |
| ChemiDox成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 微针制备 | 金属微针模具 | Maifeng | -- |
| 海藻糖 | -- | -- | |
| 蔗糖 | -- | -- | |
| 人血清白蛋白 | -- | -- | |
| 微针表征 | 扫描电子显微镜 | JSM-7500F | -- |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Zeiss LSM 800 | -- | |
| 测力计 | Mark-10 | -- | |
| 体内成像 | 活体成像系统 | PerkinElmer | -- |
| 荧光素钾盐 | -- | -- | |
| 分子检测 | 病毒基因组DNA提取试剂盒 | Vazyme | RC313-01 |
| 细胞实验 | IV型胶原酶 | -- | -- |
| ELISA | TMB溶液 | InnoReagents | -- |
| 酶标仪 | Tecan Spark 10M | -- | |
| 假病毒中和实验 | Bright-Glo™荧光素酶底物 | Promega | E2610 |
| 微板发光检测仪 | Thermo | -- | |
| 血常规分析 | 血液分析仪 | Nihon Kohden | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 微针制备 | 微针基质成分（1.67% HA，20%海藻糖）；低温两步干燥法（4°C，第一次2小时，第二次6小时）；加压填充（0.2 MPa, 3 min）和真空填充（-0.09 MPa, 6 min）条件 阅读提示：见Materials and methods中的'Fabrication and characterization of AAV loaded microneedles' |
| AAV生产 | AAV8-RBD的生产使用三重质粒转染AAV293细胞；转染后72小时收获；纯化使用亲和层析柱；病毒滴度通过qPCR测定。 阅读提示：见Materials and methods中的'Fabrication and characterization of AAV' |
| 动物实验 | BALB/c小鼠，6-8周龄，雌性；单次接种剂量1×10^11 vg；接种部位背部皮肤；微针按压3分钟 阅读提示：见Materials and methods中'APCs infection efficiency at vaccinated sites...'及'Investigation of cellular immune response'等部分 |
| 免疫应答评估 | 抗体检测时间点（第15,30,60,120,180天）；ELISA操作细节（包被RBD 0.1 μg/孔，血清3倍梯度稀释）；细胞免疫检测（第180天，RBD肽库刺激2 μg/mL，ELISPOT孵育24小时，胞内染色前刺激1小时加Brefeldin A 5小时） 阅读提示：见Materials and methods中的'Detection of RBD-specific antibodies'和'Investigation of cellular immune response' |
| 假病毒中和实验 | 血清灭活（56°C 30分钟）；起始稀释1:20，四倍梯度稀释；假病毒量2.25×10^4 TU；ACE2-293T细胞数量15,000/孔；孵育48小时 阅读提示：见Materials and methods中的'SARS-CoV-2 pseudovirus neutralization assay' |