ACE2邻近蛋白质组学鉴定
鉴定SARS-CoV-2感染后ACE2邻近蛋白的变化，寻找潜在宿主因子。
使用TurboID邻近标记技术标记ACE2邻近蛋白，通过质谱鉴定差异蛋白，筛选出STX6。
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Syntaxin-6通过促进病毒运输至自噬体来限制SARS-CoV-2感染
Syntaxin-6 restricts SARS-CoV-2 infection by facilitating virus trafficking to autophagosomes.
实验完整度
高包含邻近标记蛋白质组学、细胞感染实验、伪病毒进入分析、共定位及突变体功能验证等多个独立证据层级，并有功能获得与缺失验证。
主要模型
H1299-ACE2细胞 A549-ACE2细胞 Huh7细胞 SARS-CoV-2假病毒
重点核对
STX6敲低（siRNA）浓度10 nM或50 nM，处理36小时 STX6过表达质粒转染24小时 SARS-CoV-2感染MOI为0.1，在24小时pi检测 E-64d处理浓度20 µM 雷帕霉素0.1 µM和1 µM处理24小时
摘要
尽管严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）对全球的影响正在减弱，但该病毒仍在持续传播和发生突变，对公共卫生构成持续挑战。全面了解病毒进入机制对于管理新流行毒株至关重要。然而，内吞后的细胞过程在很大程度上仍未得到探索。本研究采用邻近标记技术检测病毒感染后ACE2附近的蛋白质，并鉴定出syntaxin-6（STX6）作为抑制SARS-CoV-2感染的因子，其通过阻碍病毒的内吞释放发挥作用。SARS-CoV-2感染增强早期内体中STX6的募集。STX6似乎阻碍携带病毒颗粒的早期内体成熟为晚期内体，而病毒可从晚期内体逃逸。相反，它促进病毒向自噬-溶酶体降解途径运输。STX6对多种SARS-CoV-2变体以及其他几种通过内吞进入的病毒表现出广谱效应。我们首次报道了STX6作为病毒感染限制因子的功能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探讨SARS-CoV-2感染后ACE2邻近蛋白的变化，并鉴定限制病毒进入的宿主因子及其作用机制。
- 核心机制
- STX6被募集至含有病毒颗粒的早期内体，阻碍其成熟为晚期内体，并促进病毒向自噬体运输，最终通过自噬-溶酶体途径降解，从而限制病毒进入。
- 主要证据
- 通过邻近标记蛋白质组学鉴定STX6为感染特异性ACE2邻近蛋白；STX6敲低增加病毒RNA、N蛋白和病毒滴度，过表达则降低；STX6敲低不影响病毒结合和内化，但增加负链RNA和dsRNA形成；STX6与病毒及LC3B共定位，并影响LC3B斑点形成。
- 研究意义
- 首次揭示STX6作为病毒进入的限制因子，具有广谱抗病毒活性，对多种SARS-CoV-2变体及内吞病毒有效，为理解宿主内在免疫机制提供新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
STX6功能验证
验证STX6对SARS-CoV-2感染的影响。
通过siRNA敲低和过表达STX6，检测病毒RNA、N蛋白和病毒滴度。
STX6对病毒进入途径的影响
确定STX6是否通过内吞途径抑制病毒进入。
使用假病毒进入实验，检测STX6对ACE2表达和病毒结合内化的影响，以及TMPRSS2和E-64d的作用。
STX6亚细胞定位研究
观察STX6在病毒感染后的亚细胞定位变化及其与内体标记物的共定位。
使用免疫荧光和活细胞成像，分析STX6与早期内体、晚期内体、溶酶体及自噬体的共定位。
STX6对病毒运输和自噬途径的影响
研究STX6是否通过自噬途径介导病毒降解。
敲低STX6后检测假病毒与内体及自噬体的共定位，并使用雷帕霉素和MHY-1485处理。
STX6结构域功能分析
确定STX6的哪些结构域对其抗病毒功能是必需的。
构建STX6缺失突变体，检测其定位和对假病毒进入的抑制能力。
广谱抗病毒活性评估
测试STX6对多种SARS-CoV-2变体和其他内吞病毒的抗病毒效果。
在STX6敲低或过表达细胞中感染不同变体病毒及其他病毒，检测病毒RNA水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 转染 | 脂质体转染试剂RNAiMAX | Invitrogen | 13778-150 |
| 脂质体转染试剂3000 | Invitrogen | L3000-015 | |
| 免疫荧光 | Hoechst 33258染料 | Invitrogen | H1398 |
| 药物处理 | 阿洛司他丁（E64d） | MedChemExpress | HY-100229 |
| MHY-1485 | MedChemExpress | HY-B0795 | |
| 雷帕霉素 | MedChemExpress | HY-10219 | |
| 蛋白质组学 | 链霉亲和素磁珠 | Pierce | -- |
| 蛋白质印迹 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| QIAamp病毒RNA小提试剂盒 | Qiagen | -- | |
| HiScript II一步法qRT-PCR SYBR Green试剂盒 | Vazyme | -- | |
| Western blot | 抗syntaxin 6多克隆抗体 | Proteintech | 10841-1-AP |
| 抗ACE2多克隆抗体 | Proteintech | 21115-1-AP | |
| 抗AXL多克隆抗体 | Proteintech | 13196-1-AP | |
| 抗TFRC单克隆抗体 | Proteintech | 66180-1-Ig | |
| 抗β-肌动蛋白单克隆抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| 抗GAPDH单克隆抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 免疫荧光 | 抗EEA1单克隆抗体 | Proteintech | 68065-1-Ig |
| 抗Rab7A多克隆抗体 | Proteintech | 55469-1-AP | |
| 抗LAMP1单克隆抗体 | Proteintech | 67300-1-Ig | |
| 抗Rab5A单克隆抗体 | Cell Signaling | 46449S | |
| 抗HA标签单克隆抗体 | Cell Signaling | 3724S | |
| 抗FLAG抗体 | Cell Signaling | 2368S | |
| 抗双链RNA单克隆抗体 | Cell Signaling | 76651L | |
| 抗刺突蛋白多克隆抗体 | Sino Biological | 40589-T62 | |
| 抗核衣壳单克隆抗体 | Sino Biological | 40143-MM05 | |
| 抗LC3B单克隆抗体 | ABclonal | A19665 | |
| 蛋白质印迹 | 过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 |
| 过氧化物酶标记山羊抗兔IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | |
| 免疫荧光 | 山羊抗兔IgG (H+L)交叉吸附二抗633 | Invitrogen | A21070 |
| 山羊抗小鼠IgG (H+L)交叉吸附二抗633 | Invitrogen | A21050 | |
| 驴抗兔IgG (H+L)高度交叉吸附二抗568 | Invitrogen | A10042 | |
| 驴抗小鼠IgG (H+L)高度交叉吸附二抗568 | Invitrogen | A10037 | |
| 驴抗兔IgG (H+L)高度交叉吸附二抗488 | Invitrogen | A21206 | |
| 驴抗小鼠IgG (H+L)高度交叉吸附二抗488 | Invitrogen | A21202 | |
| 分子克隆 | Transtart FastPfu DNA聚合酶 | TransGen Biotech | -- |
| 慢病毒包装 | psPAX2包装质粒 | Addgene | 2250 ng |
| pMD2.G包膜质粒 | Addgene | 750 ng | |
| 聚凝胺 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | 正常山羊血清 | Boster | AR1009 |
| 显微镜 | Leica STELLARIS 8 WILL共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| 活细胞成像 | Dragonfly 200转盘共聚焦显微镜 | Andor | -- |
| 成像分析 | LAS X软件 | Leica | -- |
| Imaris 9.8软件 | Oxford Instruments | -- | |
| 统计分析 | Prism 6软件 | GraphPad | -- |
| 蛋白质印迹 | 蛋白G琼脂糖 | Millipore | -- |
| 硝酸纤维素膜 | -- | -- | |
| FluorChem HD2成像系统 | Alpha Innotech | -- | |
| AlphaEaseFC软件 | Alpha Innotech | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 蛋白质组学鉴定 | A549-ACE2-TurboID细胞感染SARS-CoV-2的MOI（文中同一段有MOI=10和MOI=2不一致，需核实），生物素标记时间 阅读提示：详见Results中的'The proximal proteome of ACE2 during SARS-CoV-2 infection'和Materials and Methods中的'Sample preparation for proteomics experiment' |
| STX6功能验证 | siRNA靶序列和浓度，STX6过表达质粒剂量，病毒感染MOI和时间 阅读提示：详见Results中的'STX6 is a host factor restricting SARS-CoV-2 infection'，Figure 2 legend，以及Materials and Methods中的'RNA interference experiments'和'Virus binding and internalization assay' |
| 假病毒进入实验 | 假病毒制备方法，转导体积，检测时间 阅读提示：详见Results中的'STX6 blocks SARS-CoV-2 entry'，Figure 3 legend，以及Materials and Methods中的'Pseudovirus production and transduction' |
| 亚细胞定位与共定位 | 细胞处理时间，抗体浓度，共定位分析方法 阅读提示：详见Results中的'Endocytosis of SARS-CoV-2 induces early endosome recruitment of STX6'，Figure 4 legend，以及Materials and Methods中的'Immunofluorescent confocal microscopy and colocalization analysis' |
| 自噬途径验证 | LC3B斑点计数，雷帕霉素和MHY-1485浓度与处理时间 阅读提示：详见Results中的'STX6 mediates the trafficking of SARS-CoV-2 to autophagic-lysosomal degradation'，Figure 5 legend，以及Materials and Methods中的'Antibodies and reagents' |
| 结构域功能分析 | 突变体构建细节，转染量 阅读提示：详见Results中的'Proper localization of STX6 is required in the viral restriction function'，Figure 6 legend，以及Materials and Methods中的'Cloning' |
| 广谱抗病毒评估 | 病毒株来源，感染剂量，检测时间 阅读提示：详见Results中的'STX6 has pan-antiviral activity'，Figure 7 legend，以及Materials and Methods中的'Cell lines, viruses, and biosafety' |