同基因iPSC系构建与验证
引入ALS相关FUS和TARDBP突变，确保遗传背景一致
利用CRISPR/Cas9在DF6-9-9T.B对照iPSC系中引入FUS R495X、FUS P525L、TARDBP M337V突变及FUS敲除，并验证编辑效率和干细胞多能性。
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单细胞RNA测序揭示FUS-和TARDBP-ALS中运动神经元特有的早期线粒体功能障碍
Single-cell RNA-sequencing reveals early mitochondrial dysfunction unique to motor neurons shared across FUS- and TARDBP-ALS.
实验完整度
高包含多种同基因iPSC系（FUS P525L、R495X、TARDBP M337V、FUS KO）、单细胞RNA测序、定量免疫荧光、线粒体运动性活细胞成像及代谢分析等多层级验证。
主要模型
人诱导多能干细胞（iPSC）来源的运动神经元 人诱导多能干细胞（iPSC）来源的中间神经元 FUS P525L突变iPSC系 FUS R495X突变iPSC系
重点核对
FUS P525L和R495X突变的引入方式（CRISPR/Cas9）及纯合性状态 细胞分化方案（异质性和均质性协议）及运动神经元纯度 单细胞RNA测序的细胞类型分类标准（ISL1/2、MNX1等标记表达） 线粒体运动性测定中TMRM染色浓度和成像条件 Seahorse分析中细胞培养密度和测量时间点
摘要
FUS和TARDBP的突变导致肌萎缩侧索硬化（ALS），但运动神经元选择性变性的精确机制仍未解决。为了探究病理机制是否在突变间共享，并与功能获得或功能丧失相关，我们对携带FUS P525L、FUS R495X、TARDBP M337V突变或FUS敲除的同基因诱导多能干细胞来源的神经元类型进行了单细胞RNA测序。转录变化在运动神经元中远比中间神经元显著。约20%的运动神经元特有失调转录本在FUS突变间共享，其中一半来自功能获得。大多数表明线粒体损伤，其减弱通路与突变TARDBP M337V以及C9orf72-ALS患者运动神经元共享。ALS运动轴突中的线粒体运动性受损，即使FUS突变体核定位，也证明FUS-和TARDBP-ALS之间存在共享的毒性功能获得机制，与蛋白错误定位解耦。这些运动神经元特有的早期线粒体功能障碍可能影响存活，并代表ALS的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- FUS和TARDBP突变是否通过共享的机制导致运动神经元选择性变性？
- 核心机制
- FUS和TARDBP突变通过功能获得机制引起运动神经元特有的早期线粒体功能障碍，包括线粒体呼吸链基因下调、线粒体运动性降低，且与蛋白错误定位解耦。
- 主要证据
- 单细胞RNA测序显示运动神经元中大量共享的线粒体相关基因下调；活细胞成像显示所有ALS运动轴突中线粒体运动性降低、间距增加；蛋白水平验证部分线粒体基因表达变化。
- 研究意义
- 研究提示线粒体功能障碍是ALS的早期共性靶点，为改善线粒体功能的治疗策略提供了分子基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
运动神经元和中间神经元分化
获取不同神经元类型以比较细胞特异性反应
使用异质性协议生成约30-40%中间神经元，均质性协议生成60-80%运动神经元。
单细胞RNA测序
识别突变引起的细胞类型特异性转录变化
采用Smart-seq2对FACS分选的单细胞进行RNA测序，进行差异表达分析和基因集富集分析。
定量免疫荧光验证蛋白表达
验证转录变化在蛋白水平上的体现
对线粒体复合物蛋白（MT-CO1、MT-CO2、MT-CO3、NDUFA12）进行免疫荧光染色，并在运动轴突内定量。
线粒体代谢功能评估
检测ALS运动神经元中的线粒体呼吸功能
使用Seahorse XFe96分析仪测量完整和透化细胞的耗氧率及细胞外酸化率，并比较不同细胞系。
线粒体运动性检测
评估线粒体在轴突中的运输功能
使用TMRM标记线粒体，进行活细胞延时成像，并使用TrackMate 7分析线粒体运动性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
基因编辑与细胞系构建
单细胞转录组分析
差异表达与通路分析
线粒体运动性分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | mTeSR1培养基 | Stem cell Technologies | 85870 |
| 基质胶 | Corning | 354277 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| EDTA | ThermoFisher | 15575020 | |
| ReLeSR | Stemcell Technologies | 05872 | |
| 神经元分化 | LDN193189 | Tocris | 6053 |
| SB431542 | Tocris | 1614 | |
| SHH-C25II | R&D Systems | 464-SH-025 | |
| Purmorphamine | Tocris | 4551 | |
| 视黄酸 | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| 抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| db-cAMP | Tocris | 1141 | |
| DAPT | Tocris | 2634 | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010 | |
| NT-3 | R&D Systems | 267-N3-025 | |
| CNTF | R&D Systems | 257-NT-010 | |
| SAG | Tocris | 6390 | |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12604021 | |
| 纤连蛋白 | ThermoFisher | 33016015 | |
| 多聚-L-鸟氨酸 | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| 层粘连蛋白A | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| 5-氟脱氧尿苷 | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| 单细胞RNA测序 | Triton X-100 | Sigma | -- |
| 重组RNA酶抑制剂 | Takara | 2313B | |
| dNTP | ThermoFisher | R1121 | |
| Smarter-oligo-dTVN | Biomers.net | -- | |
| ERCC Spike-In | ThermoFisher | 4456740 | |
| 甜菜碱 | Sigma-Aldrich | -- | |
| SuperScript II逆转录酶 | ThermoFisher | -- | |
| Smarter-TSO | Biomers.net | -- | |
| SPRI磁珠 | -- | -- | |
| Nextera样本制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| HiSeq 2000 | Illumina | -- | |
| NovaSeq 6000 | Illumina | -- | |
| 流式分选 | FACSAria III | BD Biosciences | -- |
| FACSAria Fusion | BD Biosciences | -- | |
| 免疫荧光 | 抗FUS抗体 (4H11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-47711 |
| 抗GAPDH抗体 (6C5) | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | |
| 抗TARDBP抗体 | Proteintech Group | 12892-1-AP | |
| 抗TARDBP抗体 (克隆41-7.1) | Santa Cruz Biotechnology | sc-100871 | |
| 抗磷酸化TDP-43 (S409/S410)抗体 克隆1D3 | Sigma-Aldrich | MABN14 | |
| 抗OCT3/4抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | |
| 抗NANOG抗体 (H155) | Santa Cruz Biotechnology | sc-33759 | |
| 抗TUBB3抗体 (Tuj1) | Biolegend | 801202 | |
| 抗NFH多克隆IgY | Millipore | AB5539 | |
| 抗ISL1/2抗体 (39.4D5) | DSHB | 39.4D5-c | |
| 抗ISL1抗体 | Abcam | ab20670 | |
| 抗Hb9 (MNX1)抗体 克隆81.5C10 | DSHB | 81.5C10-c | |
| 抗TOM22抗体 (1C9-2) | Sigma-Aldrich | T6319 | |
| 抗MT-CO1抗体 (EPR19642) | Abcam | ab203917 | |
| 抗MT-CO2抗体 | Proteintech | 55070-1-AP | |
| 抗MT-CO3抗体 | Sino Biological | 202683-T10-100 | |
| 抗NDUFA12抗体 | Thermo Scientific | PA5-58973 | |
| 抗GAD67抗体 | Sigma | ZRB1090 | |
| Hoechst33342 | -- | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| Fluoromount G封片剂 | ThermoFisher Scientific | 00-4958-02 | |
| Vectashield封片剂 | Vectashield | H-1400 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Sigma Aldrich | R0278-50ML |
| Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | 78441 | |
| Cyanase核酸酶 | Serva | 18542.02 | |
| Bolt Tris-Bis凝胶 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| iBlot2转印仪 | -- | -- | |
| Odyssey CLx扫描仪 | Li-Cor | -- | |
| qPCR | Qiazol裂解液 | Qiagen | -- |
| MESA GREEN qPCR预混液 | Eurogentec | -- | |
| ABI 7500 Fast | Applied Biosystems | -- | |
| Seahorse | Seahorse XFe96分析仪 | Agilent Technologies | -- |
| XF基础培养基 | Agilent | 102353-100 | |
| 葡萄糖 | Sigma | G6152 | |
| 谷氨酰胺 | Gibco, ThermoFisher | 25030024 | |
| 寡霉素 | Sigma | O4876 | |
| 鱼藤酮 | Sigma | R8875 | |
| 2-脱氧葡萄糖 | Sigma | D8375 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA检测试剂盒 | Invitrogen, ThermoFisher | P7589 | |
| 毛地黄皂苷 | Sigma | D141 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A3803 | |
| ADP | Sigma | 117105 | |
| 苹果酸 | Sigma | 02288 | |
| 琥珀酸 | Sigma | S3674 | |
| 抗坏血酸盐 | Sigma | A92902 | |
| TMPD | Sigma | 87890 | |
| 线粒体运动性成像 | TMRM（四甲基罗丹明甲酯） | ThermoFisher Scientific | I34361 |
| 成像优化BrainPhys培养基 | Stemcell Technologies | 05796 | |
| SM1 NeuroCult添加剂 | Stemcell Technologies | 05711 | |
| Axio Observer 7显微镜 | Zeiss | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞分化 | 分化协议（异质性 vs 均质性）、细胞接种密度、胚胎体形成条件、生长因子浓度（如SHH、RA、CHIR99021）及时间点（第10天、第14天） 阅读提示：Methods中的In vitro differentiation to heterogenous spinal neurons和In vitro differentiation to spinal motor neurons |
| 单细胞RNA测序 | 细胞分类标准（NEFM、SNAP25、ISL1/2、MNX1、SLC18A3等表达阈值），测序文库制备参数（Smart-seq2），测序深度和质量过滤标准（>100,000 reads, >5000 genes） 阅读提示：Methods中的Single-cell RNA-Seq mapping and cell type classification |
| 定量免疫荧光 | 抗体浓度、固定和通透条件、图像采集参数（显微镜型号、放大倍数、z-stack设置） 阅读提示：Methods中的Immunofluorescence microscopy |
| 线粒体代谢检测 | 细胞培养密度、Seahorse注射化合物浓度（oligomycin 5 µg/ml, 2,4-DNP 100 µM, rotenone 4 µM, antimycin A 2 µM）、透化剂浓度、归一化方法（DNA含量） 阅读提示：Methods中的Extracellular flux XFe 96 Seahorse measurements |
| 线粒体运动性成像 | TMRM染色浓度（50 nM）和孵育时间、成像培养基、延时拍摄参数（6分钟，0.5 Hz）、追踪软件参数（TrackMate 7, StarDist） 阅读提示：Methods中的Live cell imaging for tracking mitochondria |