生成并表征hPSC来源的肝类器官
建立具有多种肝细胞类型和功能的肝类器官模型，用于后续病毒感染研究
通过逐步分化将hiPSC分化为定型内胚层和肝系细胞，再通过3D培养形成肝类器官，并鉴定其细胞组成、功能特性和基因表达。
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利用人多能干细胞来源的肝类器官模拟登革病毒感染用于抗病毒药物筛选
Recapitulating dengue virus infection with human pluripotent stem cell-derived liver organoids for antiviral screening.
实验完整度
高包含体外类器官模型、Huh7细胞系和AG6小鼠模型等多个独立证据层级，并进行了功能验证（药物处理、基因敲低）和机制验证（NRF2通路、线粒体功能）
主要模型
人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的肝类器官（hPLO） 人胚胎干细胞（H1、H9）来源的肝类器官 Huh7肝癌细胞系 AG6小鼠模型（IFNα/γR1-/-）
重点核对
DENV-2感染剂量：1 PFU/类器官片段 药物处理浓度：7DMA 1μM，JNJ1802 1μM，ORES 10μM，RTA 408 0.2μM AG6小鼠给药方案：ORES 60mg/kg口服BID，RTA 408 15mg/kg口服QD，连用5天 DENV-2攻毒剂量：1×10^5 PFU/只小鼠
摘要
登革病毒（DENV）对全球健康构成重大威胁，估计每年感染1亿至4亿人。其感染和发病机制尚不完全清楚，目前尚无批准用于DENV治疗的抗病毒药物。在此，我们开发了一种人多能干细胞（hPSC）来源的肝类器官（hPLO）模型，用于表征DENV感染并筛选抗病毒药物。hPLO包含多种肝细胞类型，对DENV-2感染高度易感，导致严重的细胞死亡和形态学变化，模拟了重症登革热病例中观察到的病理变化。对DENV-2感染的hPLO进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）揭示，增殖的肝细胞样细胞是DENV-2的主要靶细胞，并伴有显著的线粒体损伤和细胞类型组成的变化。在hPLO中进一步药物筛选，确定氧化白藜芦醇（Oresveratrol, ORES）和奥马韦洛酮（RTA 408）是有效的抗DENV候选药物。这些化合物通过激活NRF2通路、减少氧化应激和保持线粒体功能来增强对DENV-2感染的抵抗力。ORES和RTA 408的功效在已建立的AG6小鼠模型中得到进一步验证。我们的研究不仅建立了hPLO作为研究DENV感染和发病机制的有价值平台，而且强调了NRF2介导的线粒体功能在抗病毒药物开发中的重要作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何建立能够真实模拟登革病毒感染的体外模型，并利用该模型筛选有效的抗病毒药物？
- 核心机制
- DENV-2感染导致肝细胞样细胞线粒体功能障碍，而激活NRF2通路能增强细胞对感染的抵抗力，减少氧化应激并保护线粒体功能。
- 主要证据
- 通过hPLO感染模型结合scRNA-seq发现增殖的肝细胞样细胞是主要靶细胞，且存在线粒体损伤；药物筛选显示ORES和RTA 408通过NRF2通路抑制病毒复制并恢复肝功能，并在Huh7细胞和AG6小鼠中得到验证。
- 研究意义
- 这些发现为DENV感染发病机制研究和抗病毒药物开发提供了新的体外平台，并指出NRF2介导的线粒体保护是潜在的抗病毒治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证hPLO的功能
评估hPLO是否具备正常肝细胞功能，如白蛋白分泌、尿素合成、代谢酶活性等
通过免疫荧光、TEM、CDFDA染色、Rhodamine 123转运实验、ICG摄取释放、PAS染色、ELISA检测白蛋白和AAT分泌、尿素合成，以及CYP3A4和CYP2C9活性检测来评估。
建立hPLO感染DENV-2模型
确定hPLO是否支持DENV-2的感染和复制，并评估感染引起的病理变化
将hPLO碎片（30-100μm）与1 PFU的DENV-2孵育3小时，清洗后嵌入Matrigel培养，监测形态变化、细胞死亡、病毒RNA和病毒滴度。
单细胞转录组分析DENV-2感染
揭示不同细胞类型对DENV-2的易感性差异和感染后的转录组变化
对MOCK和DENV-2感染的hPLO在感染后第1、2、8天进行scRNA-seq，分析细胞类型比例变化、病毒RNA分布和差异表达基因。
抗病毒药物筛选
利用hPLO筛选潜在的抗DENV药物，并评估其疗效
将已知抗DENV化合物（7DMA、JNJ1802等）和候选药物（ORES、RTA 408）应用于DENV-2感染的hPLO，通过形态、病毒载量、肝功能恢复等指标评价效果。
验证药物在细胞和小鼠中的抗病毒活性
在Huh7细胞和AG6小鼠模型中验证ORES和RTA 408的抗DENV-2效果，并探讨其机制是否依赖NRF2
在DENV-2感染的Huh7细胞中检测药物抑制作用；在AG6小鼠中预防性给药后感染，测定肝和血清病毒RNA；在Huh7中敲低NRF2观察抗病毒效果是否减弱。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 基质胶 | Corning | 354277, |
| E8培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 类器官分化 | 激活素A | R&D | -- |
| CHIR99021 | Selleck | -- | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | R&D | -- | |
| 骨形态发生蛋白4 | R&D | -- | |
| 肝细胞培养基 | Lonza | CC-3198 | |
| 细胞消化 | Accutase | Gibco | -- |
| 类器官分化 | N-乙酰半胱氨酸 | Sigma | -- |
| 毛喉素 | -- | -- | |
| A83-01 | -- | -- | |
| Wnt3a | R&D | -- | |
| R-spondin1 | R&D | -- | |
| 表皮生长因子 | R&D | -- | |
| 骨形态发生蛋白7 | R&D | -- | |
| 成纤维细胞生长因子4 | R&D | -- | |
| 肝细胞生长因子 | R&D | -- | |
| 抑瘤素M | R&D | -- | |
| 地塞米松 | Sigma | -- | |
| 8-溴环腺苷酸 | Selleck | -- | |
| 维生素K2 | Sigma | -- | |
| 石胆酸 | Sigma | -- | |
| 功能鉴定 | CDFDA | Invitrogen | -- |
| 罗丹明123 | Invitrogen | -- | |
| 维拉帕米 | Selleck | -- | |
| 吲哚菁绿 | Sigma | -- | |
| P450-Glo试剂盒 | Promega | -- | |
| 药物处理 | 7-脱氮-2'-C-甲基腺苷 | -- | -- |
| JNJ1802 | -- | -- | |
| 氧化白藜芦醇 | -- | -- | |
| RTA 408 | -- | -- | |
| RNA提取与qPCR | ReliaPrep RNA小量制备系统 | Promega | Z6111 |
| PrimeScript RT-qPCR试剂盒 | Takara | RR064A | |
| 病毒扩增 | Amicon Ultra-15过滤器 | Millipore | -- |
| 流式细胞术 | 可固定活力染料eFluor 780 | Invitrogen | 65-0865-14 |
| 转录因子缓冲液套装 | BD Pharmingen | 562574 | |
| DENV-2抗体 | GeneTex | GTX29202 | |
| 细胞角蛋白7/8抗体 | BD | 564709 | |
| AFP抗体 | Sino Biological | 12177-MM35-P | |
| PDGFRB抗体 | BioLegend | 323608 | |
| 二抗 | Proteintech | SA00013-1 | |
| 蛋白质印迹 | NRF2抗体 | Abcam | ab137550 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| hPLO生成 | 细胞系来源（hiPSC系名称）、分化培养基配方、细胞密度、Matrigel批号 阅读提示：Methods: Generation of human pluripotent stem cell-derived liver organoids |
| DENV-2感染 | DENV-2株（TSV01）、感染剂量（1 PFU/碎片）、孵育时间、MOI 阅读提示：Methods: DENV-2 infection and antiviral treatment |
| 药物处理 | 药物浓度（7DMA 1μM、JNJ1802 1μM、ORES 10μM、RTA 408 0.2μM）、处理时间 阅读提示：Methods: DENV-2 infection and antiviral treatment |
| 动物实验 | AG6小鼠周龄、性别、给药剂量、频率、途径、感染剂量、取材时间 阅读提示：Methods: Animal experiments |
| scRNA-seq | 细胞制备（TrypLE消化时间）、上样细胞浓度、测序平台、比对参数 阅读提示：Methods: scRNA-seq and data processing |