DMS文库设计与构建
创建包含多个饱和突变亚文库的噬菌体展示文库，以评估所有可能突变对肽结合的影响。
基于已知配体（如p53、CDCA2）设计重叠肽，每个肽15个位置突变为除半胱氨酸外的所有氨基酸，通过寡核苷酸合成和Kunkel诱变构建M13噬菌体文库，并通过NGS确认文库覆盖度。
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通过噬菌体展示深度突变扫描定义短线性基序的结合决定因素
Defining short linear motif binding determinants by phage display-based deep mutational scanning.
实验完整度
高包含体外噬菌体展示DMS筛选、荧光偏振亲和力测定、AlphaFold3结构预测及细胞感染抗病毒实验等多个独立证据层级，并进行了功能验证和机制分析。
主要模型
M13噬菌体展示文库 E. coli表达的重组蛋白域 VeroE6细胞SARS-CoV-2感染模型
重点核对
噬菌体展示文库构建：Kunkel诱变、T4连接酶和T7聚合酶处理条件 噬菌体筛选：10 μg GST标签蛋白固定、1011噬菌体孵育、第2和3轮筛选数据组合 荧光偏振亲和力测定：FITC标记肽、缓冲液组成、KD值计算 细胞感染实验：VeroE6细胞、MOI=0.5、8小时感染时间、qPCR检测
摘要
深度突变扫描已成为评估突变对结合或功能影响的有力方法。在此，我们开发了一种基于噬菌体展示的深度突变扫描方案，以定义短线性基序与肽结合域结合的特异性决定因素。我们首先设计了一个基准深度突变扫描文库，以评估该方法在11个不同肽结合域的已知配体上的性能，包括talin-1 PTB域、G3BP1 NTF2域和MDM2 SWIB域。与真核线性基序数据库中的参考基序集比较证实，基于噬菌体展示的深度突变扫描分析能正确识别已知的基序结合决定因素，并提供特异性决定因素的新见解，包括定义了一个具有推定延伸构象的非经典talin-1 PTB结合基序。我们设计了第二个深度突变扫描文库，旨在提供人类与SARS-CoV-2蛋白之间19种基于SLiM的相互作用的结合决定因素信息。该分析确认了病毒肽与宿主蛋白结合的亲和力决定残基，并细化了人类肽与SARS-CoV-2蛋白五个域（包括非结构蛋白NSP9）结合的共有基序。深度突变扫描分析进一步指出了增加配体对NSP3和NSP9亲和力的突变。一个亲和力增强的可透膜NSP9结合肽被发现比野生型肽具有更强的抗病毒作用。我们的研究表明，基于噬菌体展示的深度突变扫描可以高效地多重化并应用于细化结合决定因素，并展示了结果如何指导肽工程改造工作。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何通过噬菌体展示深度突变扫描方法高效定义短线性基序的结合决定因素，并应用于优化抗病毒肽？
- 核心机制
- DMS by phage display通过设计饱和突变文库，结合噬菌体展示和深度测序，量化每个突变对结合的影响，从而确定关键残基和基序扩展，并指导亲和力优化。
- 主要证据
- 通过基准文库验证了已知基序，如MDM2的FxxxWxxL、PP2A B56的LxxIxE，并发现了新的TLN1 PTB基序；在SARS-CoV-2应用中，确认并细化了NSP3、NSP9等域的基序，突变亲和力测量和AlphaFold3建模支持了这些发现，优化的NSP9肽在VeroE6细胞中表现出增强的抗病毒活性。
- 研究意义
- DMS by phage display可多重化应用于并行分析多种SLiM相互作用，提供结合决定因素信息，并指导肽类抑制剂的开发。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
噬菌体筛选与NGS测序
富集结合特定靶蛋白的噬菌体，并通过深度测序定量突变频率。
将GST标签的靶蛋白固定于微量滴定板，孵育噬菌体文库，洗涤去除未结合噬菌体，洗脱结合噬菌体并扩增，进行多轮筛选（1-4天），每次筛选后对肽编码区进行NGS测序。
PSSM生成和基序确定
根据突变富集数据生成位置特异性评分矩阵（PSSM），识别关键残基和基序。
从NGS数据计算每个肽的分数丰富度，生成PSSM和序列标志，与ELM数据库已知基序比较，并通过ROC分析评估性能。
亲和力验证和结构建模
验证DMS预测的突变对亲和力的影响，并用结构建模解释结合模式。
通过荧光偏振实验测定野生型和突变肽的解离常数，用AlphaFold3建模肽-蛋白复合物，并与已知结构比较。
抗病毒肽优化和活性测试
基于DMS数据优化NSP9结合肽的亲和力，并评估其抗病毒效果。
对NOTCH4肽进行点突变，通过FP测量亲和力，选出最佳突变体，合成Tat标记的肽，在VeroE6细胞中感染SARS-CoV-2，通过qPCR定量病毒RNA，并测试细胞活力。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 文库构建 | M13KO7辅助噬菌体 | ThermoFisher | -- |
| dU-ssDNA噬菌粒 | -- | -- | |
| T4 DNA连接酶 | Fisher Scientific | -- | |
| T7 DNA聚合酶 | Fisher Scientific | -- | |
| FastDigest SmaI | Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白表达 | GST亲和树脂 | Cytiva (GSH Sepharose 4 Fast Flow) | -- |
| cOmplete Mini蛋白酶抑制剂 | Roche | -- | |
| 亲和力测量 | SpectraMax iD5酶标仪 | Molecular Devices | -- |
| 康宁96孔半面积板 | Corning | 3993 | |
| 感染实验 | NucleoSpin RNA Plus XS | Macherey Nagel | -- |
| High-Capacity cDNA反转录试剂盒 | Thermo Fisher | -- | |
| qPCRBIO探针混合液Hi-ROX | PCR Biosystems | -- | |
| qPCRBIO SyGreen混合液Hi-ROX | PCR Biosystems | -- | |
| 活力测定 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测 | Promega | -- |
| Varioskan LUX多功能酶标仪 | ThermoFisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 文库构建 | Kunkel诱变条件、T4连接酶和T7聚合酶用量、电穿孔条件；肽序列设计（15个位置突变，排除Cys） 阅读提示：Materials and Methods, Library design, Phage library constructions; 表S1 |
| 噬菌体筛选 | 靶蛋白固定量（10 μg）、噬菌体文库用量（1011）、孵育时间（2小时）、洗涤次数（5次）、筛选轮次（第2和3轮数据组合） 阅读提示：Materials and Methods, Phage selections; 图1d |
| PSSM生成 | 非归一化数据使用；第2和3轮组合；与ELM PSSM比较方法（CompariPSSM） 阅读提示：Materials and Methods, Specificity determinant comparison, Establishing the optimal combination of selection days |
| 亲和力测量 | FP缓冲液（50 mM KPO4, pH 7.5）；FITC标记肽浓度（10 nM）；蛋白浓度范围；KD拟合方程 阅读提示：Materials and Methods, FP-monitored affinity measurements |
| 感染实验 | VeroE6细胞、MOI=0.5、感染时间8小时、肽浓度、qPCR引物和探针；细胞活力测定（CellTiter-Glo） 阅读提示：Materials and Methods, Infections experiment, Viability test; 图5g,h |