临床队列筛选sICOSL
筛选与化疗反应相关的可溶性蛋白，寻找与CTL功能障碍相关的因素。
前瞻性纳入35例HER2阴性乳腺癌患者，收集化疗前后血清和组织样本，使用多重液相蛋白定量技术检测血清蛋白，结合肿瘤组织的流式、转录组和蛋白组学分析sICOSL。
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靶向降解可溶性ICOSL逆转细胞毒性T细胞功能障碍
Targeted degradation of sICOSL reverses cytotoxic T cells dysfunction
实验完整度
高包含临床样本多组学分析、细胞共培养实验、小鼠移植瘤模型、基因敲除和回补实验、机制验证（EZH2-DPP4轴）以及纳米抗体融合蛋白的体外和体内功能验证。
摘要
细胞毒性T细胞（CTL）的功能障碍是肿瘤免疫逃逸的主要原因，并与癌症患者生存期较短相关。本研究发现，可溶性ICOSL（sICOSL）水平的升高可诱导CTL功能障碍，并与乳腺癌患者较短的生存期相关。sICOSL通过直接触发ICOS内化和随后的降解，对CTL激活所必需的共刺激机制造成严重打击，从而成为CTL的强劲对手。我们的研究表明，二肽基肽酶-4（DPP4）主要降解sICOSL。值得注意的是，某些化疗药物激活组蛋白甲基转移酶EZH2，进而抑制DPP4的表达。为解决此问题，我们开发了纳米抗体-DPP4融合蛋白，可特异性降解sICOSL，实现底物选择性和肿瘤靶向。总之，该研究揭示了sICOSL介导CTL功能障碍，并确立了sICOSL靶向降解作为一种新的免疫治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内外验证sICOSL对肿瘤生长和T细胞功能的影响
证明sICOSL是否直接促进肿瘤生长并导致CTL功能障碍。
通过小鼠移植瘤模型（4T1、EMT-6）验证sIcosl过表达、敲除及回补对肿瘤生长的影响；通过T细胞与肿瘤细胞共培养检测T细胞功能标志物；通过CD8或CD4抗体清除实验确定关键免疫细胞类型。
机制研究：sICOSL诱导ICOS内化和降解
阐明sICOSL如何导致CTL功能障碍的具体分子机制。
检测sICOSL处理后T细胞表面ICOS表达，免疫荧光观察ICOS内化及溶酶体定位，并在肿瘤模型中分析ICOS+ T细胞比例。
机制研究：化疗通过EZH2-DPP4轴调节sICOSL水平
揭示化疗药物如何调节sICOSL的释放，特别是DPP4的表达调控机制。
在细胞系中筛选化疗药物对sICOSL分泌的影响；通过抑制剂和重组蛋白验证DPP4的降解作用；通过转录组和蛋白组学数据分析DPP4与EZH2的关系；使用CHX追踪实验测定sICOSL半衰期；在MMTV-PyMT小鼠模型中验证化疗对DPP4和sICOSL的影响。
验证EZH2对DPP4的转录调控
确认EZH2是否通过表观遗传修饰直接调控DPP4表达。
在细胞系中敲低或抑制EZH2观察DPP4表达变化；通过ChIP-seq数据及ChIP实验检测DPP4启动子区域的H3K27me3修饰；在紫杉醇耐药模型中比较H3K27me3水平。
体内验证sICOSL阻断治疗对化疗/免疫治疗增效作用
评估通过遗传敲除或药物抑制sICOSL释放是否能增强化疗和免疫治疗的疗效。
使用Icosl-KO肿瘤细胞或EZH2、DPP4、ADAM10/17抑制剂与化疗和/或抗PD-1联合治疗小鼠，监测肿瘤生长和T细胞功能。
开发纳米抗体-DPP4融合蛋白并验证其靶向降解sICOSL活性
开发一种能够特异性降解肿瘤微环境中sICOSL的靶向生物制剂，并评估其疗效。
设计αHER2-DPP4和αTROP2-DPP4融合蛋白，体外检验其结合活性和对HER2/TROP2阳性肿瘤细胞分泌sICOSL的降解能力；在HER2或TROP2阳性4T1移植瘤模型中验证其抗肿瘤效果和免疫调节作用。
预后分析：sICOSL相关基因特征与患者生存
评估sICOSL相关基因表达特征对癌症患者预后及治疗反应的预测价值。
基于TCGA和METABRIC等数据库进行生存分析，比较EZH2、DPP4、ICOSLG等基因表达与总生存期的关系；在独立免疫治疗队列中验证基因特征。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 药物处理 | 紫杉醇 | Hengrui | -- |
| EZH2抑制剂他泽司他 | MedChemExpress | -- | |
| DPP4抑制剂曲格列汀 | MedChemExpress | -- | |
| ADAM10/17抑制剂TAPI-1 | MedChemExpress | -- | |
| 免疫治疗 | 抗小鼠PD-1抗体 | BioXCell | BE0146 |
| 细胞因子 | 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | R&D | -- |
| 白细胞介素-4 | R&D | -- | |
| 白细胞介素-2 | Peprotech | -- | |
| 细胞刺激 | 脂多糖 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞培养 | 重组可溶性ICOSL | Sino Biological | 11559-H08H |
| 蛋白质生产 | Expi293细胞 | -- | -- |
| Expifectamine转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白质纯化 | Ni-NTA亲和层析 | -- | -- |
| 流式细胞术 | 抗人CD3抗体 | BD | -- |
| 抗人CD4抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗人CD8抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗人颗粒酶B抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗人IFNγ抗体 | BD | -- | |
| 抗人TIM3抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗人ICOS抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗人LAG3抗体 | Biolegend | -- | |
| 可固定活性染料510或780 | BD Horizon | -- | |
| 抗小鼠CD45抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗小鼠CD3抗体 | BD | -- | |
| 抗小鼠CD4抗体 | BD | -- | |
| 抗小鼠CD8抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗小鼠IFNγ抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗小鼠颗粒酶B抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗小鼠ICOS抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗小鼠LAG3抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗小鼠EPCAM抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗小鼠CD31抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗小鼠CD19抗体 | BD | -- | |
| 抗小鼠CD68抗体 | BD | -- | |
| 抗小鼠CD11c抗体 | BD | -- | |
| 抗小鼠NKp46抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗小鼠Ly6C抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗小鼠F4/80抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗小鼠DPP4抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗人/小鼠CD16/CD32抗体 | BD | -- | |
| 细胞毒性实验 | 细胞示踪染料 | Thermo Fisher Scientific | C34557 |
| Zombie NIR可固定活性染料试剂盒 | Biolegend | -- | |
| 免疫印迹 | 抗β-肌动蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | -- |
| 抗DPP4抗体 | Abcam | -- | |
| 抗H3K27me3抗体 | Abcam | -- | |
| 抗EZH2抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗H3抗体 | Proteintech | -- | |
| 免疫组织化学 | 抗DPP4抗体 | Abcam | -- |
| 抗EZH2抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 免疫荧光 | 抗ICOS FITC抗体 | -- | -- |
| LysoTracker深红溶酶体染料 | -- | -- | |
| Dil细胞膜染料 | -- | -- | |
| DAPI核酸染料 | -- | -- | |
| RNA测序 | TruSeq链特异性mRNA制备试剂盒 | Illumina | -- |
| Illumina HiSeq 4000测序平台 | Illumina | -- | |
| 蛋白质组学 | TMTpro 16plex标记试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| XBridge Peptide BEH C18色谱柱 | Waters | -- | |
| Q Exactive HF-X四极杆-轨道阱质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 流式分选 | FACS LSRII流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 成像 | Nikon Ti-E显微镜 | Nikon | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床队列筛选 | 患者入组标准、治疗方案、样本采集时间和处理方法、sICOSL检测方法及cutoff值 阅读提示：Results 第一部分及图1A-D；补充表1 |
| 小鼠肿瘤模型 | 细胞系（4T1、EMT-6）、细胞数量、注射部位、肿瘤测量方法、治疗开始时间 阅读提示：Methods 中的 In vivo mouse study、图2、图6、图7 |
| 细胞实验 | 细胞系（MDA-MB-231、BT474、T47D等）、培养基、血清浓度、处理药物浓度和时间、效应器/靶细胞比例、共培养时间 阅读提示：Methods 中的 Cell culture、Cytotoxicity assays、图3、图7 |
| 药物处理 | 紫杉醇、EZH2抑制剂、DPP4抑制剂、ADAM10/17抑制剂、抗PD-1抗体的剂量、给药途径和频率 阅读提示：Methods 中的 In vivo mouse study，图4、图5、图6 |
| 纳米抗体融合蛋白 | 融合蛋白的序列、表达和纯化方法、给药剂量和频率、HER2或TROP2表达水平 阅读提示：Methods 中的 Protein production and purification、Cell surface binding analysis，图7；补充材料 |
| 机制研究 | CHX浓度、DPP4抑制剂浓度、重组DPP4浓度、检测时间点 阅读提示：Methods 中的 Protein degradation analysis，图4、图5 |
| 流式细胞术 | 抗体克隆号、荧光标记、染色条件、分析门控策略 阅读提示：Methods 中的 Flow cytometry，图1、图3、图6、图7 |
| 转录组和蛋白质组 | 样本类型、测序平台、数据分析流程、差异表达阈值 阅读提示：Methods 中的 Transcriptome、Quantative proteomics，图1 |