组织解离和单细胞制备
获得高活性的单细胞悬液用于下游分析。
从新鲜颅咽管瘤组织中解离细胞，包括机械解离和酶消化（胶原酶I和VII），然后进行红细胞裂解和死细胞去除。
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使用单细胞RNA测序和免疫组织化学表征颅咽管瘤亚型及其微环境的方案
Protocol for characterizing craniopharyngioma subtypes and their microenvironments using single-cell RNA sequencing and immunohistochemistry.
实验完整度
中提供了详细的实验方法（组织解离、scRNA-seq、IHC）和预期结果，但主要是方案描述，缺乏具体实验数据验证。
主要模型
患者来源的颅咽管瘤组织
重点核对
细胞活力需大于80% 测序深度需大于20,000 reads/细胞 cDNA峰大小约2000 bp，浓度大于20 ng/μL 最终文库大小400-800 bp，浓度大于10 ng/μL 免疫组化染色条件（如β-catenin: 高压灭菌121°C 5分钟；BRAF V600E: 98°C 64分钟）
摘要
在这里，我们提出了一个全面的方案，用于在单细胞分辨率下分析颅咽管瘤亚型及其肿瘤微环境。我们描述了肿瘤组织解离、单细胞分离、RNA测序文库制备和生物信息学分析程序。我们还详细介绍了用于验证发现的免疫组织化学程序。该方法能够详细表征肿瘤细胞组成、免疫细胞网络和区分成釉细胞型与乳头型颅咽管瘤的分子特征。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何通过单细胞RNA测序和免疫组织化学方法表征颅咽管瘤亚型及其微环境？
- 核心机制
- 文中未明确说明
- 主要证据
- 方案描述了组织解离、单细胞分离、文库制备和免疫组化验证的详细步骤，但未提供具体结果数据。
- 研究意义
- 该方法能够详细表征肿瘤细胞组成、免疫细胞网络和区分成釉细胞型与乳头型颅咽管瘤的分子特征。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞RNA测序文库制备
构建捕获单个细胞转录组的测序文库。
使用10x Genomics Chromium系统进行单细胞捕获和文库构建，包括GEM生成、cDNA合成和扩增、文库QC。
测序和初步分析
将文库转化为可分析的测序数据。
在NovaSeq 6000上进行配对端测序，使用Cell Ranger进行数据处理和比对。
免疫组化验证
在蛋白水平验证单细胞发现并提供空间信息。
对FFPE组织切片进行免疫荧光和免疫组化染色，检测CD80, CD163, β-catenin, BRAF V600E等标记物。
生物信息学分析
处理测序数据以识别细胞群体、分子特征和细胞间相互作用。
使用Cell Ranger处理原始数据，Seurat进行QC、归一化、降维聚类和细胞类型注释，inferCNV分析拷贝数变异，monocle3构建轨迹，CellChat分析细胞通讯。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织解离 | I型胶原酶 | Worthington | LS004194 |
| VII型胶原酶 | Worthington | LS005332 | |
| 红细胞裂解 | ACK裂解缓冲液 | Gibco | A1049201 |
| 死细胞去除 | 死细胞去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-090-101 |
| 细胞活力检测 | 吖啶橙/碘化丙啶细胞活力检测试剂盒 | Nexcelom | CS2-0106-5ML |
| 缓冲液 | 磷酸盐缓冲液（10X），pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 70011044 |
| 免疫染色封闭 | 正常山羊血清 | Thermo Fisher Scientific | 16210064 |
| 驴血清 | -- | -- | |
| 单细胞测序文库制备 | Chromium Next GEM单细胞3'试剂盒v3.1（双索引） | 10x Genomics | PN-1000268 |
| 单细胞测序 | 10x Genomics Chromium控制器 | 10x Genomics | PN-120223 |
| 文库扩增 | Bio-Rad C1000 Touch PCR仪 | Bio-Rad | 1851196 |
| 测序 | Illumina NovaSeq 6000测序系统 | Illumina | 20012850 |
| 文库质控 | TapeStation系统 | Agilent | G2991AA |
| 显微镜 | Zeiss LSM980共聚焦显微镜 | Zeiss | 410130-9901-000 |
| 移液器吸头 | 带滤芯移液器吸头1000 μL | QSP | 115-Q |
| 带滤芯移液器吸头200 μL | QSP | 114-Q | |
| 带滤芯移液器吸头200 μL | Rainin | RT-200F | |
| 带滤芯移液器吸头100 μL | QSP | 113-Q | |
| 离心管 | 1.5 mL DNA低吸附微量离心管 | Eppendorf | 022431021 |
| 15 mL锥形离心管 | Falcon | 352096 | |
| 50 mL锥形离心管 | Falcon | 352070 | |
| 细胞过滤 | 40 μm细胞过滤器 | Falcon | 352340 |
| PCR | 8联排PCR管盖 | Eppendorf | 0030124839 |
| 0.2 mL 8联排PCR管 | Eppendorf | 0030124359 | |
| 质控 | D5000 ScreenTape | Agilent | 5067-5588 |
| D5000样本缓冲液 | Agilent | 5067-5589 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| D1000样本缓冲液 | Agilent | 5067-5583 | |
| 免疫组化 | 小鼠抗人CD80单克隆抗体 | LS Bio | LS-C115599 |
| 抗CD163抗体 | Abcam | ab87099 | |
| 免疫荧光 | 驴抗小鼠IgG (H+L)高交叉吸附二抗，Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21203 |
| 驴抗兔IgG (H+L)高交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A-31573 | |
| 免疫组化 | 抗Dkk3抗体 [EPR15611] | Abcam | ab186409 |
| 重组抗Clusterin兔单克隆抗体 | Sino Biological | 11297-R013 | |
| S100A8多克隆抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-86063 | |
| 抗β-连环蛋白抗体 | Abcam | ab32572 | |
| VENTANA抗BRAF V600E (VE1)小鼠单克隆一抗（即用型） | Roche | 790-5095 | |
| VENTANA DISCOVERY ULTRA染色系统 | Roche | N2387 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 组织解离和单细胞制备 | 组织处理时间（<30分钟），酶消化时间（90分钟），细胞活力（>80%） 阅读提示：步骤1-4，图1 |
| 单细胞RNA测序文库制备 | 细胞浓度和活力（AO/PI），GEM-RT条件（53°C 45分钟，85°C 5分钟），cDNA和最终文库QC标准 阅读提示：步骤5-7，图2 |
| 测序和初步分析 | 测序参数（Read 1: 28循环，Read 2: 89循环，Index: 8循环），测序深度>20,000 reads/细胞，Cell Ranger参数（--expect-cells=10000，--include-introns=true） 阅读提示：步骤8-10 |
| 免疫组化验证 | 组织固定条件（10%中性缓冲福尔马林24-72小时），抗原修复条件（β-catenin: 121°C 5分钟或微波500W 20分钟；BRAF V600E: 98°C 64分钟），抗体稀释度（CD80 1:300, CD163 1:100, β-catenin 1:200, BRAF V600E ready-to-use） 阅读提示：步骤11-14，图3 |
| 生物信息学分析 | QC过滤参数（nFeature_RNA > 200 且 < 3000, percent.mt < 30），归一化方法（LogNormalize），降维聚类参数（dims 1:15, resolution 1.0），标记基因列表 阅读提示：步骤15-19 |