鉴定B7H3关键N-糖基化位点
确定哪些N-糖基化位点对B7H3细胞表面定位和稳定性至关重要。
在B7H3敲除细胞系中表达一系列B7H3突变体，通过流式细胞术检测细胞表面表达，通过CHX追踪和泛素化分析评估蛋白质稳定性。
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靶向位点特异性N-糖基化的B7H3诱导强效抗肿瘤免疫
Targeting site-specific N-glycosylated B7H3 induces potent antitumor immunity.
实验完整度
高研究包含体外细胞模型（HEK293T、MDA-MB-231、A549等）、体内动物模型（BALB/c、C57BL/6、人源化小鼠）及患者TCGA数据分析，并通过糖基化突变体、抗体验证、机制研究（ERAD）等进行了功能与机制验证。
主要模型
HEK293T细胞系 MDA-MB-231乳腺癌细胞系 A549肺癌细胞系 BALB/c小鼠移植瘤模型
重点核对
B7H3糖基化位点突变体（N91/104/309/322Q等） B7H3基因敲除细胞系（HEK293T-B7H3KO等） T细胞共培养及杀伤实验（人T细胞、OT-1 T细胞） 体内肿瘤模型（4T1、E0771、A549异种移植） 抗B7H3抗体（Ab-82、Hu-Ab-82）处理
摘要
B7H3是一种免疫检查点分子，是一种高度N-糖基化的膜蛋白。然而，介导B7H3蛋白功能的关键糖基化天冬酰胺残基仍不清楚。在此，我们确定附着在天冬酰胺残基N91/309和N104/322上的N-聚糖是B7H3正确定位于细胞表面膜所必需的。我们证明，这两对N-糖基化位点的突变通过阻断其从内质网到高尔基体的转运，诱导B7H3在内质网中积累，并随后通过内质网相关蛋白降解途径促进其降解。进一步的证据表明，B7H3在N91/309和N104/322位点的N-糖基化对于其抑制T细胞增殖和活化至关重要。更重要的是，开发了一种优先靶向在N91/309和N104/322位点糖基化的B7H3的单克隆抗体Ab-82，该抗体表现出通过B7H3内化引发细胞毒性T淋巴细胞介导的抗肿瘤免疫的能力。总之，这些发现为靶向糖基化B7H3作为免疫治疗的潜在策略提供了理论依据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- B7H3蛋白上哪些N-糖基化位点对其细胞表面定位和免疫功能至关重要，以及靶向这些位点能否增强抗肿瘤免疫？
- 核心机制
- B7H3在N91/309和N104/322位点的N-糖基化对于其从内质网到高尔基体的转运和细胞表面定位是必需的；这些位点的突变导致B7H3在内质网中积累，并通过HRD1/SEL1L介导的内质网相关蛋白降解途径降解，从而丧失其抑制T细胞活化的功能。
- 主要证据
- 通过糖基化突变体（N91/104/309/322Q）在多种细胞系中证实细胞表面表达降低和ERAD降解增强；体外T细胞功能实验显示突变体失去抑制T细胞增殖和活化的能力；体内肿瘤模型证实突变体肿瘤生长减慢并伴随更多活化T细胞。
- 研究意义
- 该研究确定了B7H3关键N-糖基化位点的功能，并开发了靶向糖基化B7H3的单克隆抗体Ab-82，为基于B7H3的免疫治疗提供了新策略，并为ADC药物开发提供了潜在框架。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证N-糖基化位点对ER-高尔基体转运的影响
探究关键位点突变是否影响B7H3的亚细胞定位和转运。
通过免疫荧光染色共定位B7H3与ER、ERGIC和高尔基体标志物，比较WT和突变体的定位差异。
验证突变体通过ERAD降解
确定突变B7H3是否通过ERAD途径降解。
使用IP-MS分析结合蛋白，用p97抑制剂和MG132处理检测B7H3降解，敲低或敲除HRD1/SEL1L观察B7H3稳定性变化。
评估关键位点对T细胞抑制功能的影响
体外验证关键N-糖基化位点对B7H3抑制T细胞功能的影响。
将肿瘤细胞与T细胞共培养，检测T细胞增殖、活化和杀伤能力。
体内验证关键位点对肿瘤免疫的影响
评估关键N-糖基化位点是否影响体内抗肿瘤T细胞反应。
将表达不同B7H3突变体的肿瘤细胞植入免疫健全小鼠，比较肿瘤生长和TIL中T细胞活化情况。
生成并验证糖基化特异性抗体Ab-82
开发优先识别N91/309和N104/322糖基化B7H3的单克隆抗体。
通过免疫兔子产生抗体，筛选特异性识别WT和关键位点糖基化突变体B7H3的抗体。
评估Ab-82抗肿瘤活性及其机制
验证Ab-82在体内外的抗肿瘤效果及其诱导B7H3内化降解的机制。
在4T1-hB7H3肿瘤模型和A549人源化模型中评估Ab-82疗效，通过免疫组化分析免疫细胞浸润，并检测B7H3内化和降解。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Gibco | 12491015 |
| 胎牛血清 | Gibco | A5670701 | |
| 药物处理 | MG132 | Selleck Chemical | S2619 |
| NMS-873 | Selleck Chemical | S7285 | |
| CB-5083 | Selleck Chemical | S8101 | |
| 去糖基化处理 | PNGaseF | New England Biolab | P0704S |
| 内化实验 | 伯氨喹 | TargetMol | T0850-500 |
| pHrodo Red | Thermo Fisher Scientific | P36011 | |
| 缓冲液 | HEPES | Sigma | V900477 |
| 质粒构建 | ClonExpress II一步克隆试剂盒 | Vazyme | C112-01 |
| 基因敲除 | B7H3 CRISPR/Cas9敲除质粒（人） | Santa Cruz | sc-402032 |
| B7H3 CRISPR/Cas9敲除质粒（小鼠） | Santa Cruz | sc-430440 | |
| 转染 | Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668030 |
| 基因敲除 | 对照CRISPR/Cas9质粒 | Santa Cruz | sc-418922 |
| LentiCRISPR V2质粒 | Addgene | 52961 | |
| 转染 | lipofectamine RNAimax | Invitrogen | 13778030 |
| qRT-PCR | PrimeScript RT试剂盒（带gDNA Eraser） | Takara | RR047D |
| ChamQ SYBR qPCR绿色预混液 | Vazyme Biotech Co. | Q311-03 | |
| TRIzol | -- | -- | |
| 动物实验 | 抗小鼠CD4单克隆抗体GK1.5 | Selleck | A2101 |
| 抗小鼠CD8α单克隆抗体2.43 | Selleck | A2102 | |
| 大鼠IgG2b同型对照 | Selleck | A2116 | |
| T细胞分离 | Pan T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-096-535 |
| T细胞培养 | 白细胞介素-2 | Pepro Tech | 200-02 |
| T细胞激活 | 抗CD3抗体 | BioLegend | 300313 |
| 抗CD28抗体 | BioLegend | 302913 | |
| T细胞培养 | 小鼠白细胞介素-2 | Pepro Tech | 2121220 |
| T细胞杀伤实验 | FITC活性caspase-3凋亡试剂盒 | BD Biosciences | 550480 |
| 流式细胞术 | Cytofix/CytoPerm固定/透化试剂盒 | BD Bioscience | 554714 |
| IV型胶原酶 | Sigma | -- | |
| I型脱氧核糖核酸酶 | Sigma | -- | |
| CFSE | -- | -- | |
| OVA肽（SIINFEKL） | -- | -- | |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | Cell Signaling Technology | 9806s |
| Pierce IP裂解液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 免疫沉淀 | 抗Flag亲和凝胶 | Selleck | B23102 |
| 免疫荧光 | 抗Flag亲和凝胶 | Selleck | B23102 |
| 抗ERGIC-3抗体 | Santa Cruz | sc-514611 | |
| 抗TGN38抗体 | Santa Cruz | sc-166594 | |
| 抗B7H3抗体 | abcam | ab312274 | |
| Alexa Fluor 488偶联抗小鼠IgG | Thermo Scientific | A-11001 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| 抗体生成 | 人4Ig-B7H3-His融合蛋白 | Sino Biological | 11188-H08H |
| 流式细胞术 | Alexa Fluor-647偶联抗兔二抗 | Invitrogen | A21244 |
| 商品化抗B7H3抗体 | eBioscience | 17-2769-42 | |
| 亲和力检测 | Biacore T200 | GE Healthcare Life Sciences | -- |
| 内化实验 | TrypLE Express | GIBCO | 12604013 |
| 细胞增殖 | MTT | -- | -- |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| SpectraMax Plus 384 | MD | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | 细胞系来源（ATCC）、培养基（DMEM+10%FBS）、培养条件（37°C，5% CO2）、化合物浓度（MG132、NMS-873、CB-5083）、CHX处理时间 阅读提示：Methods - Cell culture and compounds |
| B7H3敲除细胞模型构建 | CRISPR/Cas9质粒来源、转染试剂、筛选方法（嘌呤霉素）、敲除克隆鉴定 阅读提示：Methods - CRISPR–Cas9-mediated gene disruption |
| 关键糖基化位点鉴定 | 质粒构建（B7H3突变体）、转染量、检测方法（流式、免疫印迹） 阅读提示：Methods - Plasmids, Results - Identification of the vital N-glycosylation sites |
| ER-高尔基体转运分析 | 细胞系、荧光标记（mNeogreen、mRuby）、共定位标志物（KDEL、ERGIC、TGN38）、显微镜型号 阅读提示：Methods - Immunofluorescence, Results - The N-glycans attached to N91/302 and N104/322 sites of B7H3 trigger its ER-to-Golgi translocation |
| ERAD验证 | IP-MS条件、p97抑制剂浓度（NMS-873 2μM、CB-5083 5μM）、MG132处理时间、siRNA/sgRNA序列 阅读提示：Methods - Liquid chromatography-mass spectrometry, Results - The N-glycans attached to N91/302 and N104/322 sites of B7H3 block its ERAD |
| T细胞功能实验 | T细胞分离方法、共培养比例、刺激条件（抗CD3/抗CD28）、OVA肽浓度、细胞毒性实验时间 阅读提示：Methods - T lymphocytes preparations, T-cell killing assay |
| 体内动物实验 | 小鼠品系、周龄、性别、细胞接种数量、抗体清除T细胞方案（剂量和时间）、肿瘤测量频率 阅读提示：Methods - Animal treatment protocol |
| 抗体生成与鉴定 | 免疫原（人4Ig-B7H3-His）、免疫方案、单B细胞筛选方法、ELISA条件、SPR亲和力测定 阅读提示：Methods - Generation of Ab-82 and Hu-Ab-82 antibody |
| 抗体内化实验 | pHrodo标记方法、温度变化方案、primaquine浓度（50μM）、时间点 阅读提示：Methods - Internalization assay based on temperature change, pHrodo Red |