单细胞转录组分析
在PBMC水平鉴定MG患者中血小板数量的增加及转录特征的变化。
对6例个体的PBMC进行10X Genomics单细胞RNA测序，鉴定16种免疫细胞类型，分析血小板比例和基因表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
血小板活化在重症肌无力中发挥促炎作用
Platelet activation plays a pro-inflammatory role in myasthenia gravis.
实验完整度
高多证据层级：单细胞转录组、批量转录组、流式细胞术、电镜形态学、体外共培养功能实验及临床样本验证，且包含功能验证和机制验证。
主要模型
外周血单个核细胞（PBMC） 洗涤血小板 中性粒细胞与血小板共培养 naïve CD4+ T细胞与血小板共培养
重点核对
血小板计数增加：nGMG患者（n=65）vs HC（n=25）p=0.007 CD62P+血小板比例：nMG（n=50）vs HC（n=20）p=0.0307 sCD40L水平：nMG（n=24）vs HC（n=18）p=0.0199 血小板-中性粒细胞聚集体（PNAs）与QMG评分正相关（R=0.46, p=0.00084） RANTES水平在nMG血小板培养上清和血浆中升高
摘要
重症肌无力（MG）是一种通过自身抗体破坏神经肌肉接头功能的自身免疫性疾病。血小板正逐渐成为MG发病机制中的关键角色，连接先天免疫和适应性免疫。我们利用批量RNA测序和单细胞RNA测序，分析了AChR+未接受免疫治疗的MG（nMG）患者外周血单个核细胞（PBMC）中血小板转录组特征及其与免疫系统的相互作用。nMG患者表现出与活化、炎症和细胞骨架调节相关的基因上调。在PBMC中观察到血小板计数增加、活化、形态改变、CD62P表达增强以及血浆CD40L水平升高，这些变化在达到微小临床表现（MMS）后减弱。功能上，血小板与白细胞的相互作用增强，形成与疾病严重程度相关的聚集体。这些特征在静脉注射免疫球蛋白或长期免疫抑制治疗后恢复至基线水平。本研究强调了血小板活化在MG中的关键作用，并支持以血小板为靶点的治疗。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 血小板活化在重症肌无力发病机制中的作用及其与免疫细胞相互作用的机制。
- 核心机制
- 重症肌无力中血小板活化增强，通过NETs形成与中性粒细胞形成双向活化循环，并通过RANTES等可溶性因子促进CD4+ T细胞向Th1分化并抑制Treg分化。
- 主要证据
- 单细胞和批量RNA测序显示血小板活化基因上调；流式细胞术显示CD62P表达和sCD40L水平升高；体外共培养实验显示血小板与中性粒细胞双向活化；血小板上清促进Th1细胞因子分泌并抑制Treg分化。
- 研究意义
- 本研究强调了血小板活化在MG相关炎症中的关键作用，并提示血小板及其产物（如PNAs和细胞因子）可作为疾病发展和预后的生物标志物，支持以血小板为靶点的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
批量RNA测序
表征nMG患者洗涤血小板中的转录组变化。
对3例nMG和3例HC的洗涤血小板进行批量RNA测序，鉴定差异表达基因并进行通路富集分析。
血小板活化表型验证
在蛋白质水平验证血小板活化状态及形态学变化。
通过流式细胞术检测CD62P表达、sCD40L水平及血小板大小（FSC/SSC），并通过透射电镜观察血小板形态。
血小板-白细胞聚集体分析
评估活化血小板与白细胞（尤其是中性粒细胞）的相互作用。
通过流式细胞术检测血小板-白细胞聚集体（PLAs），特别是血小板-中性粒细胞聚集体（PNAs），并分析其与疾病严重程度的相关性。
血小板-中性粒细胞双向活化验证
探究血小板与中性粒细胞之间的双向活化机制。
将血小板与中性粒细胞或NETs共培养，检测血小板活化（CD62P MFI）和NETs形成（MPO-DNA复合物）。
血小板-T细胞相互作用验证
探究血小板对CD4+ T细胞增殖和分化的影响。
将血小板或血小板上清与naïve CD4+ T细胞共培养，检测T细胞增殖（CFSE）和分化（IFNγ, TNFα, IL17A, Foxp3）。
RANTES中和实验
验证RANTES在血小板介导的T细胞功能调节中的关键作用。
使用中和抗体预处理血小板，然后收集上清与T细胞共培养，检测T细胞增殖和分化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| PBMC分离 | Ficoll-Paque培养基 | Dakewe | 7111011 |
| 单细胞RNA测序 | Chromium单细胞5'试剂盒v3 | 10x Genomics | -- |
| NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- | |
| 批量RNA测序 | Qubit 3.0荧光计 | Life Technologies | -- |
| 片段分析仪 | -- | 1.0.2.9 | |
| Illumina MiSeq测序平台 | Illumina | -- | |
| 流式分析 | FACSAria III流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| FlowJo软件 | TreeStar | v10.8.0 | |
| FITC标记抗人CD62P抗体 | Biolegend | 304903 | |
| BV421标记抗人CD15抗体 | Biolegend | 323039 | |
| PE/Cyanine7标记抗人CD14抗体 | Biolegend | 325617 | |
| PerCP标记抗人CD45抗体 | Biolegend | 368505 | |
| PE标记抗人CD61抗体 | Biolegend | 336405 | |
| 红细胞裂解 | 红细胞裂解液 | Solarbio | R1010 |
| 流式分析 | 磷酸盐缓冲液 | Solarbio | P1020 |
| 牛血清白蛋白 | Miltenyi | 130-091-376 | |
| 透射电镜 | JEM-1400电子显微镜 | JEOL | -- |
| 乙醇 | General Reagent | P3223264 | |
| 环氧丙烷 | HUSHI | 80059118 | |
| EPON 812树脂 | SPI | 1280505 | |
| 醋酸铀酰 | SPI-CHEM | 1121018 | |
| 柠檬酸铅 | Electron Microscopy Sciences | 17800 | |
| 中性粒细胞分离 | CD66abce磁珠分离试剂盒 | Miltenyi | 130-092-393 |
| 血小板-中性粒细胞共培养 | RPMI-1640培养基 | HyClone | SH30027.01 |
| 胎牛血清 | Gibco | 26170043 | |
| 青霉素-链霉素 | Beyotime | C0222 | |
| NETs检测 | 抗MPO单克隆抗体 | Proteintech | 22225-1-AP |
| PicoGreen dsDNA定量试剂 | Yeasen | 12641ES01 | |
| 血小板-T细胞共培养 | MojoSort人CD4初始T细胞分离试剂盒 | Biolegend | 480041 |
| CFSE细胞分裂示踪试剂盒 | Biolegend | 423801 | |
| Dynabeads人T细胞激动剂CD3/CD28 | Gibco | 11161D | |
| 细胞刺激 | 细胞活化混合物 | Biolegend | 423302 |
| BD GolgiStop蛋白转运抑制剂 | BD Biosciences | 420701 | |
| 细胞染色 | Zombie染料 | Biolegend | 423105 |
| PerCP标记抗人CD3抗体 | Biolegend | 300427 | |
| 细胞因子染色 | PE/Cyanine7标记抗人IFNγ抗体 | Biolegend | 502527 |
| PE标记抗人TNFα抗体 | Biolegend | 502908 | |
| Brilliant Violet 421标记抗人IL17A抗体 | Biolegend | 512321 | |
| 转录因子染色 | Alexa Fluor 647标记抗人Foxp3抗体 | Biolegend | 320013 |
| True-Nuclear转录因子缓冲液套装 | Biolegend | 424401 | |
| 细胞因子中和 | 抗RANTES中和抗体 | Biolegend | 515502 |
| 抗PF4中和抗体 | Sino Biological | 10874-RP01 | |
| 抗TGF-β中和抗体 | Biolegend | 146703 | |
| 细胞因子检测 | LEGENDplex定制检测试剂盒 | Biolegend | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PBMC分离 | 使用Ficoll-Paque密度梯度离心，PBMC分离后洗涤三次，细胞活力>95% 阅读提示：Methods: 10X Genomics single-cell sequencing of peripheral blood mononuclear cells |
| 单细胞RNA测序 | 使用10x Genomics Chromium Single Cell 5'试剂盒，细胞上样量约13,000个，测序平台NovaSeq 6000，比对参考基因组GRCh38 V3.0.0 阅读提示：Methods: 10X Genomics single-cell sequencing of peripheral blood mononuclear cells |
| 批量RNA测序 | 洗涤血小板分离条件：离心190g 20min、190g 10min、1000g 10min，加入PGI2和indomethacin；RNA测序使用Smart-seq2方案，MiSeq平台35bp双端读长 阅读提示：Methods: Bulk RNA sequencing of purified, washed platelets |
| 流式分析 | 抗CD62P-FITC(1:100)、抗CD15-BV421(1:50)、抗CD14-PE/Cy7(1:300)、抗CD45-PerCP(1:100)、抗CD61-PE(1:100)，室温孵育30分钟 阅读提示：Methods: Peripheral blood flow cytometry analysis |
| 血小板-中性粒细胞共培养 | 血小板:中性粒细胞=100:1，RPMI-1640+10%FBS+1%青霉素-链霉素，37°C 5%CO2，24小时 阅读提示：Methods: Platelet-neutrophil ex vivo interaction |
| 血小板-T细胞共培养 | Tn细胞与血小板比例1:100，非接触共培养，3天，刺激用PMA(50ng/mL)和ionomycin(1μg/mL)6小时 阅读提示：Methods: Platelet-Tn ex vivo interaction |
| 细胞因子中和 | 中和抗体浓度：抗RANTES 1μg/mL、抗PF4 1:300、抗TGF-β 13.5μg/mL；孵育过夜 阅读提示：Methods: Cytokine neutralization experiment |