PROTACs与CD36结合鉴定
验证PROTACs能否直接结合CD36蛋白。
设计和合成生物素化PROTAC探针（BRD4-VHL-biotin），进行链霉亲和素拉下实验，结合质谱鉴定膜蛋白；使用表面等离子体共振（SPR）测定结合亲和力。
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CD36介导的蛋白降解靶向嵌合体的内吞作用
CD36-mediated endocytosis of proteolysis-targeting chimeras.
实验完整度
高包含体外细胞敲低/敲入、体内异种移植瘤模型、SPR结合分析、代谢组学UPLC-MS、分子建模等多个独立证据层级，并进行了功能及机制验证。
主要模型
LNCaP前列腺癌细胞 22Rv1前列腺癌细胞 HCC1806三阴性乳腺癌细胞 小鼠异种移植瘤模型
重点核对
CD36敲低对PROTACs细胞毒性和蛋白降解的影响 CD36结合亲和力与PROTACs摄取和功效的关系 前药策略中酯键的可切割性及活性药物释放 CD36表达水平与ARV-110疗效的关联
摘要
被动扩散并不能解释为什么许多药物由于过大和/或极性过强而无法突破常规膜渗透规则，例如蛋白降解靶向嵌合体（PROTACs，通常分子量>800 Da）。在这里，我们使用生物素化化学探针靶点垂钓和基因敲低/敲入方法，发现膜分化簇36（CD36）结合并促进多种PROTACs（例如，SIM1-Me、MZ1和临床药物ARV-110）以及大尺寸和/或高极性小分子抑制剂（例如，rapalink-1、雷帕霉素、navitoclax、birinapant、tubacin和阿霉素）的摄取和功效，通过CD36介导的EEA1/Rab5内体级联在体外和/或体内发挥作用。随后，我们设计了一种新型化学内吞药物化学策略，通过前药方法进行结构修饰以改善PROTACs与CD36的结合，同时显著提高PROTACs的渗透性和溶解性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探明超出类药五规则（bRo5）的大分子（如PROTACs）进入细胞的机制，以及能否通过靶向该机制提高药物渗透性和疗效。
- 核心机制
- CD36作为膜受体结合PROTACs等bRo5分子，通过EEA1/Rab5早期内体级联介导其内吞摄取。
- 主要证据
- 通过生物素化探针垂钓、质谱和免疫印迹鉴定CD36；利用shRNA敲低、过表达及恢复实验，在LNCaP、22Rv1、HCC1806细胞及异种移植瘤模型中证明CD36敲低抑制PROTACs的摄取、降解活性和抗肿瘤效果。
- 研究意义
- 揭示CD36介导的内吞是bRo5药物细胞摄取的主要途径，提出化学内吞药物化学策略，通过前药修饰增强CD36结合，同时提高渗透性和溶解度，有望改善药物生物利用度和疗效，并为精准医疗提供潜在生物标志物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CD36介导PROTACs摄取和活性验证
验证CD36介导的内吞对PROTACs细胞摄取和功能的影响。
在LNCaP等细胞中敲低CD36，检测PROTACs诱导的靶蛋白降解、细胞活力、集落形成、细胞内药物浓度（UPLC-MS）和体内异种移植瘤生长。
CD36介导PROTACs荧光探针摄取
可视化验证CD36介导PROTACs的细胞内吞。
设计合成多种BDP-FL标记的PROTAC探针，在LNCaP细胞中敲低CD36、EEA1、Rab5，利用共聚焦显微镜观察探针摄取和亚细胞共定位。
CD36介导其他bRo5分子摄取
验证CD36是否普遍介导其他大分子或高极性药物的摄取。
测试不同bRo5药物（rapalink-1、雷帕霉素、navitoclax等）对CD36敲低细胞的细胞毒性，以及BDP-FL标记的探针摄取。
优化PROTACs以增强CD36结合和摄取
通过结构修饰提高PROTACs对CD36的结合亲和力和细胞摄取。
基于MZ1设计系列前药（MZ1-Cs-Na、MZ1-Cs-NH、MZ1-Cs-NB），引入可切割酯键和不同电荷/疏水性基团，评估CD36结合、BRD4降解和细胞内浓度。
优化PROTACs的体内抗肿瘤活性评估
评估增强CD36介导摄取的前药策略对体内抗肿瘤疗效的影响。
在HCC1806和22Rv1异种移植瘤模型中，比较优化PROTAC（MZ1-C14-Na和MZ1-C12-NB）与母体MZ1的肿瘤生长抑制效果，并通过免疫组织化学检测BRD4降解。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 靶蛋白鉴定 | D-(+)-生物素 | Thermo Fisher Scientific | 58-85-5 |
| Dynabeads MyOne链霉亲和素T1磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 65601 | |
| 人重组CD36蛋白，胞外域，His标签 | Sino Biological | 10752-H08H | |
| CM5传感芯片 | Cytiva | -- | |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 细胞活力 | 噻唑蓝四氮唑溴盐 | Sigma-Aldrich | M5655 |
| 细胞增殖试剂WST-1 | Roche | 05015944001 | |
| 免疫印迹 | Clarity Max Western ECL底物试剂盒 | BIO-RAD | 1705062 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 04693132001 | |
| 免疫荧光 | ProlongGold封片剂 | Life Technologies | P36930 |
| 转染 | TurboFect转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | R0531 |
| 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | TR1003 | |
| 膜蛋白提取 | Mem-PER Plus膜蛋白提取试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 89842 |
| 核质分离 | NE-PER™核和胞质提取试剂 | Thermo Fisher Scientific | 78833 |
| 药物处理 | Birinapant | MedChemExpress | 1260251-31-7 |
| 阿霉素 | Selleckchem | 23214-92-8 | |
| Navitoclax | APExBIO | 923564-51-6 | |
| 紫杉醇 | Selleckchem | 33069-62-4 | |
| Rapalink-1 | MedChemExpress | 1887095-82-0 | |
| 雷帕霉素 | MedChemExpress | 53123-88-9 | |
| Tubacin | MedChemExpress | 537049-40-4 | |
| 探针合成 | BDP FL NHS酯 | Lumiprobe | 61420 |
| D-(+)-生物素NHS酯 | Combi-Blocks | 35013-72-0 | |
| 细胞摄取检测 | 人血清转铁蛋白，Alexa Fluor™ 546偶联物 | Invitrogen | T23364 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源和培养基条件：LNCaP、22Rv1、HCC1806细胞培养于RPMI-1640培养基，添加10% FBS和抗生素。 阅读提示：STAR Methods, Cell culture |
| CD36敲低和过表达 | shRNA序列、转染方法、筛选条件（嘌呤霉素浓度） 阅读提示：STAR Methods, Lentiviral infection generation and stable knockdown generation; Key resources table |
| PROTACs处理 | 药物浓度、处理时间、溶剂对照（DMSO） 阅读提示：Results, Figure 2 legend |
| 细胞活力检测 | MTT实验：细胞接种密度（1×10^3）、处理时间（6天）、检测波长570 nm；WST-1实验流程 阅读提示：STAR Methods, Cell viability and cytotoxicity assay |
| 免疫印迹 | 抗体信息、裂解缓冲液、ECL显色 阅读提示：STAR Methods, Immunoblotting assays; Key resources table |
| SPR分析 | 蛋白固定方法（CM5芯片）、分析物浓度、运行缓冲液 阅读提示：STAR Methods, Surface plasmon resonance studies |
| 体内实验 | 细胞接种量、小鼠品系和性别、给药方案（剂量、频率、途径）、肿瘤体积测量和计算 阅读提示：STAR Methods, Animal studies |