MET增强Amivantamab与EGFR的结合及抗体依赖性细胞毒性

MET Enhances Amivantamab Binding to EGFR and Antibody-Dependent Cellular Toxicity.

作者信息Shigeki Sato, Neval Yilmaz, Sachiko Arai, Katsuya Sakai, Hiroki Sato, Yuya Murase, Tsukasa Ueda, Hayato Koba, Shigeki Nanjo, Yuichi Tambo, Hiroshi Kotani, Koji Fukuda, Hiroaki Taniguchi, Romain Amyot, Holger Flechsig, Hideko Isozaki, Kunio Matsumoto, Seiji Yano

PMID41206690

期刊Cancer Sci

发布时间2026-01

DOI10.1111/cas.70228

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实验完整度

高

包含体外生化结合实验（HS-AFM、凝胶过滤）、结构预测与柔性拟合、细胞功能验证（ADCC、CRISPR敲除），多层级证据支持结论。

主要模型

人NSCLC细胞系（PC-9、HCC827、H1975等，含EGFR外显子19缺失或L858R突变） MET敲除NSCLC细胞系（PC-9 MET-KO、HCC827 MET-KO）重组EGFR-ECD和MET-ECD蛋白（体外结合实验）

重点核对

HS-AFM观察时使用的蛋白浓度（amivantamab 5 μg/mL，EGFR/MET ECD 5 μg/mL）及缓冲液（1 mM PBS）凝胶过滤实验中各蛋白浓度（1000 nM）及孵育时间（30分钟） ADCC实验中效应细胞（人MNCs）与靶细胞比例（E:T = 20）及抗体浓度范围 MET敲除细胞系构建方法（CRISPR-Cas9）及MET表达缺失验证 ADCC活性与EGFR表达的相关性分析

摘要

Amivantamab是一种靶向表皮生长因子受体（EGFR）和MET的双特异性抗体，已被批准用于治疗伴有EGFR外显子20插入突变以及常见EGFR突变（如外显子19缺失和L858R）的非小细胞肺癌（NSCLC）。MET作为肺癌治疗靶点备受关注；然而，其在EGFR结合和amivantamab诱导的抗体依赖性细胞毒性（ADCC）中的作用仍不清楚。我们使用高速原子力显微镜（HS-AFM）实时观察amivantamab与EGFR细胞外域（ECD）和MET-ECD的结合，并可视化了amivantamab与EGFR结构域3和MET Sema结构域的结合。此外，我们观察到由amivantamab与EGFR和MET结合形成的三聚体。凝胶过滤级分的Western blot分析显示，MET-ECD增强了amivantamab与EGFR-ECD的结合，促进了三聚体的形成。此外，amivantamab在具有常见EGFR突变的NSCLC细胞中诱导了单核细胞介导的ADCC。ADCC活性与肿瘤细胞中EGFR的表达呈正相关。使用MET敲除NSCLC细胞的研究显示，MET在低浓度amivantamab下增强ADCC活性。因此，MET增强了amivantamab与EGFR的结合，并在低amivantamab浓度下增强ADCC活性。这些结果表明，与MET的结合有助于amivantamab在具有常见EGFR突变的NSCLC中增强疗效。

结构预测与HS-AFM观察

确定amivantamab与EGFR和MET的结合位点及动态结合行为。

利用AlphaFold 3预测amivantamab及其与EGFR-ECD、MET-ECD复合物的结构；使用HS-AFM实时观察amivantamab单独、与EGFR-ECD、MET-ECD以及两者共同存在时的结合动态。

凝胶过滤分析结合增强

验证MET-ECD是否能增强amivantamab与EGFR-ECD的结合。

将amivantamab、EGFR-ECD、MET-ECD（各1000 nM）混合孵育后通过Superdex 200凝胶过滤，收集级分并用Western blot检测EGFR和MET。

细胞表达与ADCC检测

评估amivantamab在EGFR突变NSCLC细胞系中的ADCC活性及其与EGFR/MET表达的关系。

使用流式细胞术和Western blot检测多种NSCLC细胞系的EGFR和MET表达；通过LDH释放实验检测amivantamab诱导的MNC介导的ADCC，并分析ADCC活性与EGFR或MET表达的相关性。

MET敲除验证功能

确证MET表达对amivantamab诱导ADCC的贡献。

使用CRISPR-Cas9在PC-9和HCC827细胞中敲除MET，比较亲本和敲除细胞在不同amivantamab浓度下的ADCC活性。

实验环节	名称	品牌	货号
HS-AFM观察	USC-F1.2-k0.15探针	NanoWorld	--
蛋白结合实验	Amivantamab	Janssen Pharmaceuticals	--
His标签重组人EGFR	Bio-Techne R&D Systems	11302-ER
重组人MET	Sino Biological	10692-H08H
Western blot	抗His标签抗体	Cell Signaling Technology	#12698
人HGFR/c-MET抗体	R&D Systems	MAB3582

实验环节

名称

品牌

货号

HS-AFM观察

USC-F1.2-k0.15探针

NanoWorld

蛋白结合实验

Amivantamab

Janssen Pharmaceuticals

His标签重组人EGFR

Bio-Techne R&D Systems

11302-ER

重组人MET

Sino Biological

10692-H08H

Western blot

抗His标签抗体

Cell Signaling Technology

#12698

人HGFR/c-MET抗体

R&D Systems

MAB3582

环节	核对要点
HS-AFM观察	蛋白浓度（amivantamab 5 μg/mL，EGFR/MET ECD 5 μg/mL），缓冲液（1 mM PBS），扫描速率（125-255 ms/帧）阅读提示：Materials and Methods 2.1；Figure legends 1-4
凝胶过滤	蛋白浓度（各1000 nM），孵育时间（30分钟），缓冲液（PBS含0.01% Tween 20），凝胶柱（Superdex 200）阅读提示：Materials and Methods 2.4；Figure 5
细胞培养与处理	细胞系（PC-9、HCC827等），EGFR突变类型（外显子19缺失、L858R），EGFR/MET表达水平阅读提示：Materials and Methods 2.5；Figure 6A,B
ADCC实验	效应细胞（人MNCs），效靶比（E:T=20），amivantamab浓度（包括低浓度约1 ng/mL和高浓度≥10 ng/mL），共培养时间（文中未明确说明）阅读提示：Materials and Methods 2.5；Figure 6E,F；Figure 7D,E
MET敲除	敲除方法（CRISPR-Cas9），靶细胞（PC-9、HCC827），敲除验证（Western blot、流式）阅读提示：Materials and Methods 2.5；Figure 7A-C

环节

核对要点

HS-AFM观察

蛋白浓度（amivantamab 5 μg/mL，EGFR/MET ECD 5 μg/mL），缓冲液（1 mM PBS），扫描速率（125-255 ms/帧）

阅读提示：Materials and Methods 2.1；Figure legends 1-4

凝胶过滤

蛋白浓度（各1000 nM），孵育时间（30分钟），缓冲液（PBS含0.01% Tween 20），凝胶柱（Superdex 200）

阅读提示：Materials and Methods 2.4；Figure 5

细胞培养与处理

细胞系（PC-9、HCC827等），EGFR突变类型（外显子19缺失、L858R），EGFR/MET表达水平

阅读提示：Materials and Methods 2.5；Figure 6A,B

ADCC实验

效应细胞（人MNCs），效靶比（E:T=20），amivantamab浓度（包括低浓度约1 ng/mL和高浓度≥10 ng/mL），共培养时间（文中未明确说明）

阅读提示：Materials and Methods 2.5；Figure 6E,F；Figure 7D,E

MET敲除

敲除方法（CRISPR-Cas9），靶细胞（PC-9、HCC827），敲除验证（Western blot、流式）

阅读提示：Materials and Methods 2.5；Figure 7A-C

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