单细胞转录组图谱构建
鉴定正常和IUA子宫内膜中的主要细胞类型及其基因表达特征。
对9例增殖期个体的子宫内膜样本进行scRNA-seq，经过质量控制获得96,509个细胞，通过无监督聚类鉴定出上皮、基质、内皮和免疫细胞四类主要细胞类型。
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单细胞测序揭示基质细胞-巨噬细胞通讯紊乱是宫腔粘连进展的驱动因素
Single-cell sequencing uncovers disrupted stromal-macrophage communication as a driver of intrauterine adhesion progression.
实验完整度
高涵盖scRNA-seq、免疫组化、体外细胞刺激、空间转录组分析及跨月经周期整合分析，包含功能验证和机制验证。
主要模型
人子宫内膜组织样本（正常、宫腔粘连、粘连旁组织） 原代子宫内膜成纤维细胞
重点核对
scRNA-seq样本来自9例增殖期个体，包含正常、轻度和中度IUA及粘连旁组织 免疫组化验证CD68、S100A8、CCL2、CCL5、COL1A1、α-SMA在正常和IUA子宫内膜中的表达（每组n=4） 体外刺激实验使用SPP1（100 ng/ml）和CCL5（100 ng/ml）处理原代子宫内膜成纤维细胞48小时 质控标准：细胞基因数200-7500，线粒体基因表达<20%，使用DoubletFinder去除双细胞
摘要
宫腔粘连（IUA）以子宫内膜纤维化为特征，严重威胁女性生殖健康，但其分子机制仍知之甚少。在此，我们使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）对增殖期九名个体的139,395个单细胞进行了分析。我们鉴定了七个基质细胞亚群和五个巨噬细胞亚群，揭示了免疫细胞浸润增加和巨噬细胞状态的促纤维化转变。免疫组化证实IUA组织中CD68+巨噬细胞升高，S100A8、CCL2、CCL5和SPP1表达升高。体外实验中，巨噬细胞来源的CCL5和SPP1促进成纤维细胞向肌成纤维细胞转变。轨迹和配体-受体分析强调了促纤维化巨噬细胞谱系和TGF-β信号传导是纤维化的关键驱动因素。与分泌期单细胞数据的整合提供了跨月经周期IUA的全面视角。这些发现揭示了巨噬细胞-基质细胞相互作用在IUA进展中的关键作用，并提出了潜在的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 宫腔粘连（IUA）中，巨噬细胞和基质细胞如何相互作用并驱动子宫内膜纤维化进展？
- 核心机制
- 巨噬细胞来源的CCL2、CCL5和SPP1促进成纤维细胞向肌成纤维细胞转变，TGF-β信号通路是纤维化的关键驱动因素。
- 主要证据
- scRNA-seq揭示IUA中巨噬细胞亚群变化和促纤维化特征；免疫组化证实相关因子表达升高；体外实验表明CCL5和SPP1促进肌成纤维细胞形成。
- 研究意义
- 研究揭示了巨噬细胞-基质细胞相互作用在IUA发病中的关键作用，为开发针对这些相互作用的治疗策略提供了基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
基质细胞亚群分析
探究基质细胞在IUA纤维化中的异质性和功能变化。
对基质细胞进行亚聚类，鉴定出7个亚群（S0-S6），分析各亚群在疾病进展中的比例变化、差异表达基因、功能富集、代谢活性和转录因子活性。
巨噬细胞亚群和轨迹分析
阐明巨噬细胞异质性及其在纤维化中的发育轨迹和功能转变。
对免疫细胞进行亚聚类，鉴定出6个巨噬细胞亚群，并通过Monocle 2进行拟时间分析，揭示单核细胞向不同巨噬细胞亚群的分化轨迹。
细胞间通讯分析
揭示巨噬细胞与基质细胞之间在IUA中的信号相互作用。
使用CellChat分析不同疾病状态下细胞间的配体-受体相互作用，重点关注TGF-β、SPP1和补体信号通路。
组织学验证
在蛋白水平验证scRNA-seq发现的巨噬细胞相关因子和纤维化标志物的表达。
通过免疫组化检测正常和IUA子宫内膜中CD68、CCL2、CCL5、S100A8、COL1A1和α-SMA的表达；Masson三色染色评估纤维化程度。
体外功能验证
验证巨噬细胞来源的因子对成纤维细胞向肌成纤维细胞转变的作用。
分离原代子宫内膜成纤维细胞，用SPP1（100 ng/ml）或CCL5（100 ng/ml）处理48小时，通过RT-qPCR检测COL1A1和ACTA2的表达。
跨月经周期整合分析
综合评估IUA在增殖期和分泌期的细胞和分子变化。
整合3个公开数据集和本研究数据，共42例个体约240,000个细胞，分析不同月经周期阶段IUA的细胞组成和基因表达变化，并构建上皮细胞轨迹。
空间转录组映射
确定基质细胞和巨噬细胞亚群在子宫内膜中的空间分布。
使用cell2location将scRNA-seq数据映射到公开的Visium空间转录组数据中，分析不同细胞亚群在子宫内膜层中的定位。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 单细胞悬液制备 | 杜氏磷酸盐缓冲液 | Gibco | 14190144 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099-141 | |
| IV型胶原酶 | Gibco | 17104-019 | |
| 中性蛋白酶 | Corning | 354235 | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
| TrypLE Select | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 红细胞裂解液 | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | B2064 | |
| 台盼蓝 | Invitrogen | T10282 | |
| 单细胞文库构建 | Chromium单细胞3'文库与凝胶珠试剂盒v3 | 10x Genomics | -- |
| 测序 | Illumina HiSeq X Ten | Illumina | -- |
| NovaSeq 6000 | Illumina | -- | |
| 免疫组化 | COL1A1抗体 | Abcam | ab138492 |
| α-SMA抗体 | Abcam | ab124964 | |
| CD68抗体 | Abcam | ab955 | |
| S100A8抗体 | Affinity | DF6556 | |
| CCL2抗体 | Sino-biological | 10134-T26 | |
| CCL5抗体 | Affinity | DF7427 | |
| 体外刺激 | SPP1重组蛋白 | PeproTech | 120-35-100UG |
| CCL5重组蛋白 | Novoprotein | C062 | |
| RT-qPCR | MiniBEST通用RNA提取试剂盒 | TaKaRa | 9767 |
| PrimeScript™ RT试剂盒（含gDNA Eraser） | TaKaRa | RR047 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集 | 子宫内膜样本来自增殖期，且未经外源性激素治疗。 阅读提示：Methods: Ethics and clinical sample collection |
| 单细胞悬液制备 | 酶消化条件：1 mg/mL Collagenase IV, 2.5 IU/mL Dispase, 100 μg/mL DNase I, 37°C, 50 r.p.m, 20-30 min。 阅读提示：Methods: Endometrium tissue dissociation and preparation of single-cell suspensions |
| 单细胞文库构建与测序 | 使用Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v3，测序平台为Illumina HiSeq X Ten或NovaSeq 6000，PE150模式。 阅读提示：Methods: Chromium 10× Single-cell library preparation and sequencing |
| 数据质控 | 细胞过滤标准：基因数200-7500，线粒体基因<20%。 阅读提示：Methods: Filtering of low-quality cells and removal of doublets |
| 免疫组化 | 抗体稀释比例：COL1A1 (1:400), α-SMA (1:400), CD68 (1:200), S100A8 (1:200), CCL2 (1:200), CCL5 (1:200)。 阅读提示：Methods: Immunohistochemistry |
| 体外刺激实验 | 原代子宫内膜成纤维细胞用SPP1 (100 ng/ml)或CCL5 (100 ng/ml)处理48小时。 阅读提示：Methods: Gene expression analysis by real-time PCR, Figure 7d-e legend |
| RT-qPCR | 使用MiniBEST Universal RNA Extraction Kit (TaKaRa, 9767)提取RNA，PrimeScript™ RT reagent kit (RR047)合成cDNA，2^-ΔΔCt方法计算表达变化。 阅读提示：Methods: Gene expression analysis by real-time PCR |