序列分析和物种选择
比较不同沙贝病毒RBD的保守性，并确认狐狸ACE2代表性
结构比对沙贝病毒RBD序列，并比对红狐和北极狐ACE2序列，确定仅6个氨基酸差异且不位于结合界面。
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狐狸ACE2与不同沙贝病毒RBD的结合及结构基础
The binding and structural basis of fox ACE2 to RBDs from different sarbecoviruses.
实验完整度
高包含SPR结合实验、假病毒感染实验、冷冻电镜结构分析和突变验证等多层次证据，明确验证了受体结合和关键氨基酸的作用。
主要模型
HEK293F悬浮细胞 HeLa-fox ACE2细胞系 狐狸ACE2蛋白与RBD复合物 VSV假病毒系统
重点核对
RBD蛋白表达和纯化：使用HEK293F细胞表达，His-Trap HP和Superdex 200纯化 SPR实验：BIAcore 8K，CM5传感器，单循环模式，RBD梯度稀释 假病毒感染：HeLa-fox ACE2细胞，VSV-ΔG-GFP假病毒，qRT-PCR定量，感染15-18小时后计数 冷冻电镜样品制备：GO包被的网格，Vitrobot Mark IV，样品浓度0.1 mg/ml 结构解析：Titan Krios，Gatan K3，cryoSPARC v.4.2.0，分辨率2.96-3.47 Å
摘要
狐狸在实验室环境中对SARS-CoV-2易感，并且也有狐狸自然感染SARS-CoV和SARS-CoV-2的报道。在本研究中，我们评估了狐狸ACE2与重要的沙贝病毒（包括SARS-CoV、SARS-CoV-2以及动物来源的SARS-CoV-2相关病毒）的结合能力。我们的研究结果表明，狐狸ACE2对沙贝病毒的受体结合域（RBD）表现出广泛的结合能力。我们进一步解析了狐狸ACE2与SARS-CoV、SARS-CoV-2原型株（PT）和Omicron BF.7的RBD复合物的冷冻电镜结构。通过结构分析，我们发现K417突变可以削弱SARS-CoV-2亚变体与狐狸ACE2的结合能力，从而降低狐狸对SARS-CoV-2亚变体的易感性。此外，SARS-CoV RBD中的Y498残基在与狐狸ACE2受体中的K353形成关键的阳离子-π相互作用中起关键作用。这种相互作用是SARS-CoV RBD与SARS-CoV-2 PT RBD相比具有更高亲和力的主要决定因素。这些结果表明，狐狸是多种沙贝病毒的潜在宿主，凸显了监测工作的关键重要性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 狐狸ACE2能否与不同沙贝病毒的RBD结合，以及结合的结构基础是什么？
- 核心机制
- K417突变破坏狐狸ACE2 E30与RBD K417之间的盐桥，降低SARS-CoV-2亚变体的结合；SARS-CoV RBD的Y498与狐狸ACE2 K353形成阳离子-π相互作用，增强结合亲和力。
- 主要证据
- SPR结合实验显示狐狸ACE2与多种RBD结合，其中SARS-CoV RBD亲和力高于PT；冷冻电镜结构解析了复合物结构，并通过点突变（K417N、Y505H、N501Y、K417V、Q498Y、N501T）验证了关键残基的作用。
- 研究意义
- 研究表明狐狸是多种沙贝病毒的潜在宿主，为监测和预防溢出提供理论依据，并为跨物种传播提供结构基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
SPR结合实验
测定狐狸ACE2与不同沙贝病毒RBD的结合亲和力
利用表面等离子共振（SPR）技术，固定狐狸ACE2，分析各RBD的KD值。
假病毒感染实验
验证狐狸ACE2介导的伪病毒进入能力
使用VSV-ΔG-GFP假病毒（RaTG13、GD/1/2019、SARS-CoV、PT、Omicron BA.1、BF.7）感染HeLa-fox ACE2细胞和阴性对照HeLa细胞。
冷冻电镜结构解析
揭示狐狸ACE2与RBD复合物的分子结构
制备fox ACE2/PT RBD、fox ACE2/Omicron BF.7 RBD、fox ACE2/SARS-CoV RBD复合物，并进行冷冻电镜数据收集和结构解析。
突变体结合实验
验证关键氨基酸残基对结合亲和力的影响
针对PT RBD进行点突变（K417N、N501Y、Y505H、K417V、Q498Y、N501T），通过SPR测定突变体与狐狸ACE2的亲和力。
结构分析和关键残基比较
分析不同复合物中结合界面的差异
比较fox ACE2/PT RBD、fox ACE2/Omicron BF.7 RBD和fox ACE2/SARS-CoV RBD复合物的结构和结合细节。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
结合亲和力检测
结构建模与验证
序列比对
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | SMM 293-TII表达培养基 | Sino Biological | Cat# M293TII |
| HEK293F细胞 | Gibco | Cat# 11625-019 | |
| 蛋白纯化 | His-Trap HP 亲和色谱 | GE Healthcare | -- |
| SuperdexTM 200 Increase 10/300 GL 色谱柱 | GE Healthcare | -- | |
| SPR分析 | BIAcore 8K 分子相互作用仪 | GE Healthcare | -- |
| CM5传感器芯片 | GE Healthcare | -- | |
| 假病毒感染 | BaseMuncher 核酸内切酶 | Abcam | Cat# ab270049 |
| 病毒RNA提取试剂盒 | Bioer Technology | Cat# BYQ6.6.101711-213 | |
| 7500 Fast 实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| CQ1共聚焦图像细胞仪 | Yokogawa | -- | |
| 冷冻电镜样品制备 | Vitrobot Mark IV 自动快速冷冻仪 | ThermoFisher Scientific | -- |
| 冷冻电镜数据采集 | Titan Krios 透射电子显微镜 | ThermoFisher Scientific | -- |
| Gatan K3探测器 | Gatan | -- | |
| GIF Quantum能量过滤器 | Gatan | -- | |
| EPU自动采集软件 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 图像处理 | MotionCor2 | -- | -- |
| cryoSPARC v.4.2.0 | -- | -- | |
| 模型构建 | Chimera | -- | -- |
| Coot v.0.9.3 | -- | -- | |
| Phenix-1.20.1 | -- | -- | |
| 模型验证 | Molprobity | -- | -- |
| 结构分析 | PyMol v.2.0 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| SPR结合实验 | 狐狸ACE2固定量，RBD浓度梯度，缓冲液（PBST, pH 7.4），温度，重复次数 阅读提示：Materials and methods - Surface plasmon resonance (SPR) analysis |
| 假病毒感染实验 | 假病毒定量（qRT-PCR），感染剂量，感染时间（15-18小时），细胞数量，平行组数（8个） 阅读提示：Materials and methods - Pseudovirus assay |
| 冷冻电镜样品制备与数据采集 | 复合物浓度，网格类型（GO-coated, R1.2/1.3, 300 mesh），blot条件，显微镜参数 阅读提示：Materials and methods - Cryo-EM sample preparation and data acquisition |
| 突变体结合实验 | 突变体类型和位置，蛋白表达纯化条件，SPR参数（同SPR实验） 阅读提示：Materials and methods - Surface plasmon resonance (SPR) analysis; Results - The key residues determining... |