抗体筛选与分离
从COVID-19康复者记忆B细胞中筛选能中和BQ.1.1和XBB谱系的中和抗体。
从COVID-19康复者外周血中分离记忆B细胞，培养后筛选上清液中和活性，获得抗体7F3。
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一种双特异性抗体对SARS-CoV-2 Omicron变异株XBB.1.16、BQ.1.1及sarbecoviruses具有广泛中和活性
A bispecific antibody exhibits broad neutralization against SARS-CoV-2 Omicron variants XBB.1.16, BQ.1.1 and sarbecoviruses.
实验完整度
高包含抗体筛选、体外中和实验、动物模型预防/治疗实验和冷冻电镜结构解析等多个独立证据层级，且包含功能验证和机制验证。
主要模型
HEK293T细胞 Huh-7细胞 HEK293F细胞 K18-ACE2转基因小鼠 BALB/c小鼠
重点核对
抗体7F3的分离来源：COVID-19康复者外周血记忆B细胞 中和实验使用的假病毒面板：28种SARS-CoV-2变异株和sarbecoviruses 动物实验剂量：G7-Fc 200 μg/小鼠（i.p.）或20 μg/小鼠（i.n.） 感染剂量：105 FFU XBB.1 检测时间点：感染后48小时
摘要
Omicron亚变体BQ.1.1、XBB.1.5和XBB.1.16以其逃避免疫反应的能力而闻名。在此，我们分离出一种中和抗体7F3，其能够中和所有测试的SARS-CoV-2变异株，包括BQ.1.1、XBB.1.5和XBB.1.16。7F3靶向受体结合基序（RBM）区域，并对一组37种RBD突变蛋白表现出广泛的结合能力。我们利用7F3和交叉中和抗体GW01开发了IgG样双特异性抗体G7-Fc。G7-Fc对所有28种测试的SARS-CoV-2变异株和sarbecoviruses表现出强大的中和活性，并在K18-ACE和BALB/c雌性小鼠中对XBB.1感染提供了有效的预防和治疗效果。G7-Fc与Omicron XBB刺突（S）三聚体复合物的冷冻电镜结构分析揭示了一种三聚体-二聚体构象，其中G7-Fc协同靶向两个不同的RBD表位并阻断ACE2结合。对7F3和LY-CoV1404表位的比较分析突出了RBM区域中7F3结合的一个独特且高度保守的表位，促进了免疫逃逸Omicron变异株XBB.1.16的中和。G7-Fc有望成为针对SARS-CoV-2的潜在预防性对策，特别是针对流行和新兴变异株。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何开发能够广泛中和包括高度免疫逃逸的Omicron亚变体（如BQ.1.1、XBB.1.5和XBB.1.16）在内的SARS-CoV-2变异株及sarbecoviruses的抗体？
- 核心机制
- G7-Fc双特异性抗体通过7F3和GW01分别结合RBD上的两个不同表位（RBM内保守表位和RBM外表位），协同阻断ACE2结合，并诱导S三聚体形成三聚体-二聚体，从而增强中和活性。
- 主要证据
- 体外假病毒中和实验显示G7-Fc中和100%的28种测试假病毒（GM IC50=0.13 nM）；体内实验显示G7-Fc在K18-ACE2和BALB/c小鼠中对XBB.1感染具有预防和治疗效果；冷冻电镜结构解析了G7-Fc与XBB S三聚体复合物的结构。
- 研究意义
- G7-Fc有望成为针对SARS-CoV-2的潜在预防性对策，特别是针对流行和新兴变异株。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
抗体结合特性分析
评估7F3对多种RBD变异蛋白的结合特异性和亲和力。
通过ELISA和BLI检测7F3对SARS-CoV-2各种变异株RBD的结合和亲和力。
表位作图
确定7F3在RBD上的结合表位及其与ACE2的竞争关系。
使用37种RBD突变蛋白进行结合实验，并通过BLI竞争实验检测7F3与ACE2的竞争。
双特异性抗体构建
构建基于7F3和GW01的双特异性抗体，以增强中和广度和效力。
将7F3和GW01的scFv融合到IgG1 Fc，构建G7-Fc和7G-Fc。
双特异性抗体功能验证
评估G7-Fc对假病毒和真实病毒的中和活性。
使用假病毒中和实验检测G7-Fc对28种假病毒的中和，并使用FRNT检测对BQ.1和XBB.1真实病毒的中和。
体内预防和治疗效果评估
评估G7-Fc对XBB.1感染小鼠的预防和治疗效果。
在K18-ACE2和BALB/c小鼠中，通过腹腔或鼻内给药G7-Fc，感染XBB.1后检测肺病毒载量。
冷冻电镜结构解析
解析G7-Fc与XBB S三聚体复合物的结构，阐明中和机制。
通过冷冻电镜技术解析XBB S/G7-Fc复合物的结构，并进行局部 refinement。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| SMM 293-TII表达培养基 | Sino Biological Inc. | -- | |
| 抗体筛选 | 白细胞介素21 | Invitrogen | -- |
| 白细胞介素2 | Roche | -- | |
| 3T3msCD40L饲养细胞 | NIH reagent program | -- | |
| 抗体表达与纯化 | 蛋白G琼脂糖珠 | Smart-Lifesciences | -- |
| 假病毒生产 | EZ Trans转染试剂 | Life-iLab, China | -- |
| 假病毒中和实验 | 荧光素酶底物 | Promega | -- |
| ELISA | 辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG抗体 | Jackson ImmunoResearch | 109-035-098 |
| ABTS底物溶液 | -- | -- | |
| BLI | Octet Ni-NTA生物传感器 | Sartorius | -- |
| Octet RED96仪器 | Sartorius | -- | |
| AHC生物传感器 | -- | -- | |
| FRNT | 兔抗SARS-CoV-N IgG | Sino Biological | 40143-R001 |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Jackson ImmunoResearch | -- | |
| KPL TrueBlue过氧化物酶底物 | Seracare Life Sciences Inc | -- | |
| EliSpot读板仪 | Cellular Technology Ltd. | -- | |
| 蛋白纯化 | Ni琼脂糖 | -- | -- |
| Histrap HP亲和柱 | GE Healthcare | -- | |
| Superose 6 increase 10/300凝胶过滤柱 | GE Healthcare | -- | |
| 冷冻电镜样品制备和成像 | Vitrobot IV | FEI/Thermo Fisher Scientific | -- |
| 冷冻电镜数据采集 | TITAN Krios G4透射电镜 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Falcon 4i相机 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Selectris X成像过滤器 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 冷冻电镜结构分析 | Relion3.1 | -- | -- |
| MotionCor2 | -- | -- | |
| Gctf | -- | -- | |
| cryoSPARC v4.0.3 | -- | -- | |
| DeepEMhancer | -- | -- | |
| 结构分析 | UCSF Chimera | -- | -- |
| COOT | -- | -- | |
| PHENIX | -- | -- | |
| Molprobity | -- | -- | |
| UCSF ChimeraX | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 抗体筛选 | 样本来源：COVID-19康复者外周血；B细胞培养条件：IL-21, IL-2, 3T3msCD40L饲养细胞；筛选时间：2周 阅读提示：Methods: Isolation and characterization of SARS-CoV-2-specific monoclonal antibodies |
| 假病毒中和实验 | 细胞系：Huh-7；感染时间：24小时；抗体与病毒孵育时间：30分钟 阅读提示：Methods: Pseudovirus neutralization assay |
| 真实病毒中和实验 | 细胞系：Vero E6；病毒量：180 FFU；孵育时间：1小时 阅读提示：Methods: Neutralizing assay by focus reduction forming assays (FRNT) |
| 动物实验 | 小鼠品系：K18-ACE2（n=5）和BALB/c（n=4），雌性，6周龄；给药剂量：腹腔200 μg/小鼠或鼻内20 μg/小鼠；感染剂量：105 FFU XBB.1；检测时间：感染后48小时 阅读提示：Methods: Prophylactic and therapeutic efficacy of G7-Fc against XBB.1 infection of mice |
| 冷冻电镜结构解析 | 复合物形成：XBB S与G7-Fc摩尔比1:1.3，4°C孵育0.5小时；最终浓度0.5 mg/ml 阅读提示：Methods: Formation of XBB S/G7-Fc complex |