检测circE7表达与临床相关性
评估circE7在HNSCC组织中的表达及其与T细胞浸润的相关性
对23对HNSCC肿瘤及癌旁组织进行PCR检测circE7，对105例石蜡包埋组织进行原位杂交和免疫组化检测circE7、p16、E7、CD8A和galectin-9，并分析相关性。
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人乳头瘤病毒编码的环状RNA circE7促进头颈部鳞状细胞癌的免疫逃逸
Human papillomavirus-encoded circular RNA circE7 promotes immune evasion in head and neck squamous cell carcinoma.
实验完整度
高包含体外细胞实验、体内异种移植模型和同源原位模型，并进行了功能验证（T细胞杀伤）和机制验证（circE7结合ACC1、表观遗传调控）
主要模型
HPV阴性HNSCC细胞系CAL27和HN30 HPV16阳性HNSCC细胞系SCC090和SCC154 BALB/c裸鼠异种移植瘤模型 C3H小鼠同源原位肿瘤模型（SCC-7细胞）
重点核对
circE7在HPV+ HNSCC组织中的表达（23对样本中7例阳性） CD8+ T细胞浸润和效应分子（IFNG, GZMB, TNFA）水平与circE7负相关 ACC1与circE7的结合（RNA pulldown和RIP验证） ACC1抑制剂TOFA处理可恢复circE7下调的LGALS9表达 联合抗PD-1和抗TIM-3抗体治疗的体内效果
摘要
免疫逃逸是癌症进展中的关键里程碑，也是肿瘤免疫治疗的理论基础。在本研究中，我们揭示了人乳头瘤病毒（HPV）编码的环状RNA circE7与头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中CD8+ T细胞浸润之间的负相关关系。体外和体内实验均表明，circE7通过下调编码galectin-9蛋白的LGALS9的转录来抑制T细胞的功能和活性。其分子机制涉及circE7与乙酰辅酶A羧化酶1（ACC1）结合，促进其去磷酸化从而激活ACC1。激活的ACC1减少LGALS9基因启动子处的H3K27乙酰化，导致galectin-9表达降低。值得注意的是，galectin-9与免疫检查点分子TIM-3和PD-1相互作用，抑制T细胞分泌细胞毒性细胞因子并促进T细胞凋亡。在此，我们展示了HPV通过circE7驱动的表观遗传修饰促进HNSCC免疫逃逸的机制，并提出了一种涉及抗PD-1和抗TIM-3抑制剂联合使用的潜在HNSCC免疫治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- HPV编码的circE7是否以及如何促进HNSCC的免疫逃逸，以及联合靶向PD-1和TIM-3能否增强免疫治疗效果？
- 核心机制
- circE7结合ACC1并促进其去磷酸化激活，激活的ACC1降低细胞内乙酰辅酶A水平，减少LGALS9启动子区H3K27乙酰化，从而下调galectin-9表达，进而抑制CD8+ T细胞功能并促进T细胞凋亡。
- 主要证据
- 体外共培养实验、RNA pulldown、RIP、ChIP-qPCR、异种移植模型和同源原位模型证实了circE7通过ACC1和H3K27ac下调LGALS9，并验证了联合抗PD-1和抗TIM-3的治疗效果。
- 研究意义
- 作者提出circE7和galectin-9可作为HPV16+ HNSCC免疫治疗疗效和预后的潜在预测标志物，并建议联合使用抗PD-1和抗TIM-3抑制剂以改善免疫治疗效果。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外验证circE7对T细胞功能的影响
验证circE7是否通过LGALS9抑制T细胞功能
在CAL27和HN30中过表达circE7，或在SCC090和SCC154中敲低circE7，与人原代T细胞共培养，通过RT-qPCR、ELISA和流式细胞术检测T细胞效应分子和凋亡。
验证galectin-9与TIM-3和PD-1的结合
确定galectin-9增强T细胞抗肿瘤活性的分子机制
在HNSCC细胞中过表达或敲低LGALS9，加入TIM-3或PD-1单克隆抗体或乳糖，共培养后检测T细胞细胞因子和凋亡。
阐明circE7下调LGALS9的分子机制
揭示circE7结合ACC1并调控表观遗传的机制
通过RNA pull-down和质谱鉴定circE7结合蛋白，RIP验证与ACC1的结合，检测ACC1磷酸化、乙酰辅酶A水平、组蛋白乙酰化，并通过ChIP-seq和ChIP-qPCR分析LGALS9启动子区H3K27ac水平。
评估联合免疫治疗的体内效果
验证联合抗PD-1和抗TIM-3治疗在体内的疗效
使用HN30和SCC090细胞建立异种移植瘤模型，以及SCC-7细胞同源原位模型，给予抗PD-1和抗TIM-3治疗，检测肿瘤体积、免疫细胞浸润和细胞因子表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | C11995500BT |
| 胎牛血清 | Gibco | 10270106 | |
| 青霉素-链霉素溶液 | BI | 03-03101B | |
| 无血清细胞冻存液 | NCM Biotech | C40100 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| 逆转录 | HiScript cDNA合成试剂盒 | Vazyme | R323-01 |
| qRT-PCR | 通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q511-02 |
| CFX Connect实时荧光定量PCR检测系统 | Bio-Rad | -- | |
| PCR | Golden Star T6超级PCR预混液 | Tsingke | TSE101 |
| Mastercycler nexus热循环仪 | Eppendorf | -- | |
| 琼脂糖凝胶电泳 | UltraPure琼脂糖 | ThermoFisher | 16500100 |
| SolarRed核酸染料 | Solarbio | G5560 | |
| Bio-Rad Universal Hood II凝胶成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 细胞转染 | Neofect DNA转染试剂 | Neofect biotech | -- |
| Hiperfect转染试剂 | Qiagen | -- | |
| 靶向circE7的siRNA | Genepharma | -- | |
| RNA FISH | DAPI | Invitrogen | D1306 |
| STELLARIS 5共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| 免疫组化 | Elivision Plus 聚合物HRP免疫组化试剂盒 | Maxim | KIT-9902 |
| 原位杂交 | 增强敏感ISH检测试剂盒I (POD) | BOSTER | MK1030 |
| RNA pull-down | 链霉亲和素亲和磁珠 | Thermo Scientific | 20164 |
| 蛋白质提取 | RIPA裂解液 | Epizyme Biomedical | PC101 |
| SDS-PAGE | 10% SDS-PAGE凝胶 | Servicebio | G2177 |
| 蛋白质转印 | 聚偏二氟乙烯膜 | Millipore | IPVH00010 |
| Western blot成像 | 化学发光成像分析系统 | Servicebio | G2020 |
| RNA-IP | RNase抑制剂 | Invitrogen | 10777019 |
| 乙酰辅酶A检测 | 乙酰辅酶A检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | MAK039 |
| 信号检测 | SpectraMax M多功能酶标仪 | Molecular Devices | -- |
| ChIP实验 | Pierce磁珠ChIP试剂盒 | Thermo Scientific | 26157 |
| 免疫细胞分离 | Ficoll分离液 | Cytiva | -- |
| 树突状细胞制备 | 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | Sino Biological | 51048-MNAH |
| 白细胞介素-4 | Sino Biological | GMP-11846-HNAE | |
| 干扰素-γ | Sino Biological | 11725-HNAE | |
| T细胞扩增 | CD3/CD28扩增磁珠 | Miltenyi | 130-091-441 |
| 白细胞介素-2 | Sino Biological | 10360-HNCE | |
| 白细胞介素-7 | Sino Biological | -- | |
| 白细胞介素-15 | Sino Biological | -- | |
| ELISA | TNF-α ELISA试剂盒 | ZCIBIO | ZC-M6765 |
| GZMB ELISA试剂盒 | ZCIBIO | ZC-33834 | |
| IFN-γ ELISA试剂盒 | ZCIBIO | ZC-32271 | |
| 流式细胞术 | Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒 | Invitrogen | BMS500FI |
| DxP Athena流式细胞仪 | Cytek Biosciences | -- | |
| 动物实验 | DiR荧光染料 | ThermoFisher | -- |
| 抗PD-1单克隆抗体 | Selleck | A2002 | |
| 抗TIM-3单克隆抗体 | Selleck | A2037 | |
| 小动物成像 | 小动物活体成像系统 | Bruker | -- |
| 细胞转染 | TOFA (ACC1抑制剂) | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本分析 | 样本量、HPV状态、circE7表达定量方法、CD8+ T细胞浸润评估方法 阅读提示：Methods中的Patient samples及Figure legends (Fig.1) |
| 细胞培养与转染 | 细胞系来源、培养基组成、转染试剂、siRNA序列 阅读提示：Methods中的Cell lines和Vectors, siRNA sequences, and cell transfection |
| 体外共培养 | 共培养比例、时间、细胞因子检测方法 阅读提示：Figure legends (Fig.2, Fig.3) 及Methods中的T细胞制备 |
| 分子机制实验 | RNA pull-down条件、RIP条件、ChIP-qPCR条件、ACC1磷酸化检测 阅读提示：Methods中的RNA pulldown and western blotting, RNA-IP, ChIP-qPCR |
| 动物实验 | 小鼠品系、样本量、细胞注射数量、抗体剂量和治疗时间 阅读提示：Methods中的Animal experiments及Figure legends (Fig.7, Fig.8) |