DOTS的设计与表征
构建和验证DNA折纸张力传感器，并确认其可消除分子间FRET并具有膜流动性。
设计并组装了40x80 nm的单层DNA折纸结构，带有荧光团-淬灭剂对的DNA发夹，通过凝胶电泳和原子力显微镜验证结构，并通过FRAP测量其流动性。
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使用DNA折纸张力传感器量化膜连接处的T细胞受体力学
Quantifying T cell receptor mechanics at membrane junctions using DNA origami tension sensors.
实验完整度
高包含体外细胞实验、球形脂双层微粒模型、细胞-细胞连接实验，以及多种药物抑制和高度调控验证。
主要模型
OT-1转基因小鼠来源的初始CD8+ T细胞 效应OT-1 T细胞 球形支持脂双层微粒 静息B细胞
重点核对
DOTS在DOPC SLB上的密度为214±8分子/μm² 锁定链浓度为200 nM T细胞与DOTS-SLB共孵育时间为10分钟或30分钟 T细胞-B细胞共孵育时间为30分钟 F-肌动蛋白抑制剂CK666（50 μM）和Lat-B（5 μM）处理
摘要
T细胞受体（TCR）被认为是一种机械传感器，意味着它将机械力传递给其抗原，并利用该力来放大TCR信号的特异性和强度。尽管已经提出了多种分子探针来量化TCR的机械转导，然而大多数力探针固定在硬质基底上，因此无法揭示细胞膜生理环境中的力学。在这里，我们开发了DNA折纸张力传感器（DOTS），它们在DNA折纸面包板上承载力传感器，并允许在动态膜间连接处绘制TCR机械转导图。我们测量了流动TCR-抗原键上的机械力，并证明了它们对细胞状态、抗原流动性、抗原效能、抗原高度和F-肌动蛋白活性的依赖性。DOTS的可编程性使我们能够将其系在微粒上，通过流式细胞术高通量机械筛选抗原。此外，DOTS被锚定到活B细胞上，从而能够量化免疫细胞-细胞连接处的TCR力学。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TCR在生理膜间连接处传递的机械力的大小和来源是什么？
- 核心机制
- TCR-抗原键在流动界面上经历超过8 pN的力，这些力由F-肌动蛋白依赖的细胞骨架收缩和界面处大蛋白的排斥产生。
- 主要证据
- 使用DNA折纸张力传感器（DOTS）在流动SLB、球形SLB微粒和活B细胞上检测TCR力，结合荧光寿命成像和流式细胞术，并通过药物抑制和抗原高度调控验证。
- 研究意义
- DOTS提供了一种量化免疫细胞机械转导的工具，可用于表征T细胞克隆的生物物理特性、研究共受体力学以及抗原筛选。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
T细胞在DOTS包被SLB上的相互作用和力检测
研究T细胞在流动膜界面上与DOTS的相互作用，并检测TCR传递的机械力。
将初始CD8+ T细胞铺在包被pMHC-DOTS和ICAM-1的DOPC SLB上，观察DOTS的排除和集中，使用FLIM和锁定链策略测量TCR力。
探究TCR力的来源
确定TCR力产生的关键细胞骨架成分和膜弯曲的作用。
使用细胞骨架药物处理T细胞，观察张力信号变化，并通过延长抗原高度减少膜弯曲，检测张力信号和TCR信号变化。
球形支持脂双层上的TCR力测量
在非平面界面上模拟抗原呈递细胞，实现高通量测量TCR力。
将DOTS系在球形SLB微粒上，与T细胞形成结合物，通过共聚焦显微镜和流式细胞术分析张力信号。
活B细胞上的TCR力测量
在真实的免疫细胞-细胞连接处量化TCR力。
将DOTS锚定到活B细胞膜上，与T细胞形成结合物，使用显微镜和流式细胞术检测力信号。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 材料 | 二油酰磷脂酰胆碱 | Avanti Polar Lipids Inc. | 850375C |
| 镍-氮基三乙酸-二硬脂酰磷脂酰甘油 | Avanti Polar Lipids Inc. | 790404C | |
| 二棕榈酰磷脂酰胆碱 | Avanti Polar Lipids Inc. | 850355C | |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Corning Mediatech | 35-015-CV |
| 青霉素-链霉素溶液 | Corning Mediatech | 30-234-CI | |
| 硫酸庆大霉素溶液 | Corning Mediatech | 30-005-CR | |
| 缓冲液 | 1M Tris | ThermoFisher | AM9856 |
| 0.5 M EDTA | ThermoFisher | AM9260G | |
| 1M MgCl2 | ThermoFisher | AM9530G | |
| 细胞培养 | RPMI培养基 | ThermoFisher | 11835030 |
| 荧光标记 | Texas Red™ DHPE | ThermoFisher | T1395MP |
| 细胞因子 | 人白介素-2 | ThermoFisher | PHC0026 |
| 流式细胞术 | CellTrace™ CFSE | ThermoFisher | C34570 |
| 荧光染色 | Cellmask质膜染料 | ThermoFisher | C10046 |
| 封闭 | 牛血清白蛋白 | Sigma Aldrich | 10735078001 |
| 细胞骨架抑制剂 | 拉特伦库林B | Sigma Aldrich | L5288 |
| 荧光标记 | Atto647N N-羟基琥珀酰亚胺酯 | Sigma Aldrich | 18373-1MG-F |
| Atto488 N-羟基琥珀酰亚胺酯 | Sigma Aldrich | 41698-1MG-F | |
| 过滤 | 100 kDa Amicon ultra-0.5离心过滤器 | Sigma Aldrich | UFC510096 |
| 缓冲液 | Hank's平衡盐溶液 | Sigma Aldrich | H8264-6X500ML |
| 荧光标记 | Cy3B N-羟基琥珀酰亚胺酯 | GE Healthcare | PA63101 |
| 细胞骨架抑制剂 | CK666 | Abcam | ab141231 |
| Blebbistatin | STEMCELL | 72402 | |
| 蛋白 | 链霉亲和素 | Rockland Immunochemicals Inc. | S000-01 |
| 抗原 | 生物素化pMHC卵清蛋白 | NIH Tetramer Core Facility | -- |
| 纯化 | P2尺寸排阻凝胶 | Bio-Rad | 1504118 |
| 设备 | 3毫升注射器 | BD bioscience | -- |
| 细胞过滤 | 细胞过滤器 | Biologix | 15-1100 |
| 细胞分离 | Midi MACS (LS)启动套件 | Miltenyi Biotec | 130-042-301 |
| 小鼠CD8+ T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | |
| 静息小鼠B细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-090-862 | |
| DNA合成 | 寡核苷酸 | Integrative DNA Technologies | -- |
| 寡核苷酸 | Biosearch Technologies | -- | |
| 蛋白 | His-ICAM-1 | Sino Biological | 50440-M03H |
| 抗体 | 抗小鼠CD28抗体 | BioLegend | 102102 |
| 生物素化抗小鼠CD3e抗体 | BioLegend | 100304 | |
| FITC抗小鼠TCRβ抗体 | BioLegend | 109206 | |
| 点击化学 | 叠氮-PEG4-NHS酯 | Click Chemistry Tools | AZ103-100 |
| Sulfo-DBCO NHS酯 | Click Chemistry Tools | A124-10 | |
| 免疫染色 | Alexa 488小鼠抗ZAP70 (pY319)/Syk (Y352)抗体 | BD Biosciences | 557818 |
| DNA支架 | 单链支架DNA，p7560型 | tilibit nanosystems | -- |
| 细胞系 | EL-4细胞 | ATCC | -- |
| B16-F10细胞 | -- | -- | |
| 荧光成像 | 尼康Eclipse Ti倒置显微镜 | Nikon | -- |
| Evolve电子倍增电荷耦合器件 | Photometrics | -- | |
| Intensilight落射荧光光源 | Nikon | -- | |
| CFI Apo 100X（数值孔径1.49）物镜 | Nikon | -- | |
| 全内反射荧光发射器 | Nikon | -- | |
| 共聚焦显微镜 | 尼康共聚焦显微镜 | Nikon | -- |
| FLIM | 尼康Ti Eclipse倒置共聚焦显微镜 | Nikon | -- |
| Picoquant激光扫描显微镜TCSPC升级 | Picoquant | -- | |
| Abberior STED显微镜 | Abberior | -- | |
| 流式细胞术 | CytoFlex流式细胞仪 | Beckman coulter | -- |
| AFM | Bruker MultiMode NanoScope V原子力显微镜 | Bruker | -- |
| Bruker ScanAsyst-Fluid+悬臂 | Bruker | -- | |
| 细胞骨架标记 | 鬼笔环肽-iFluor488 | Abcam | ab176753 |
| DNA纯化 | Zeba离心脱盐柱 | ThermoFisher | -- |
| 蛋白定量 | Micro BCA蛋白测定试剂盒 | ThermoFisher | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| DOTS制备 | DNA折纸组装条件：p7560支架浓度30 nM，锚定链和染料标记链浓度，退火程序（90°C 15分钟，冷却至4°C，速率1°C/min）。 阅读提示：Methods: Preparation of DOTS |
| SLB制备和DOTS锚定 | SLB脂质组成（98% DOPC + 2% DGS-NTA），SUV浓度0.5 mg/mL，胆固醇DNA链浓度250 nM，DOTS浓度5 nM。 阅读提示：Methods: Preparation of DOTS functionalized planar SLB |
| T细胞力检测 | OT-1小鼠初始CD8+ T细胞，锁定链浓度200 nM，细胞与表面接触时间（10或30分钟）。 阅读提示：Methods: Harvest and purification of primary naïve OT1 T cell, Results: Figure 3 |
| 药物处理 | 细胞骨架抑制剂浓度：Blebbistatin 50 μM，CK666 50 μM，Lat-B 5 μM，AX-024 500 nM。 阅读提示：Methods: Results: Figure 4 |
| 球形SLB实验 | 二氧化硅微球直径5 μm，DOTS浓度5 nM，300,000个DOTS-SSLB与300,000个T细胞混合，锁定链浓度200 nM，孵育30分钟。 阅读提示：Methods: Preparation of DOTS functionalized spherical SLB (SSLB) |