体外验证 Spry 缺失对上皮分支的影响
验证 Spry1/2/4 缺失的成纤维细胞是否促进乳腺上皮类器官的分支。
从野生型和 Spry1fl/fl;Spry2fl/fl;Spry4fl/fl 小鼠中分离原代成纤维细胞，经 Ad-Cre-GFP 感染获得对照和 Spry1,2,4-KO 成纤维细胞，并与野生型乳腺类器官在 Matrigel 中共培养；同时使用条件培养基培养类器官。
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Sprouty 基因调控乳腺上皮发育与乳腺癌中的活化成纤维细胞
Sprouty genes regulate activated fibroblasts in mammary epithelial development and breast cancer.
实验完整度
高包含体外共培养分支实验、体内基因敲除小鼠模型、单细胞转录组分析、磷酸化蛋白质组学、胶原收缩实验及人类乳腺癌数据库分析等至少两个独立证据层级，并含功能验证与机制验证。
主要模型
小鼠乳腺上皮类器官与基质成纤维细胞共培养体系 Fsp1-cre; Spry1Δ/fl; Spry2Δ/fl; Spry4Δ/fl (Spry-TKO) 小鼠模型 小鼠乳腺基质成纤维细胞亚群 (MSF-1至MSF-4) 人类乳腺癌样本及4T1小鼠乳腺癌模型
重点核对
Spry1、Spry2、Spry4 在基质成纤维细胞中的敲除效率（Ad-Cre-GFP 感染后 mRNA 水平） 共培养体系中类器官与成纤维细胞的比例（约1:100）及培养时间（4天） 体内实验中 Fsp1-cre 介导的 Spry 基因敲除及对照基因型（Fsp1-cre; Spry1fl/+; Spry2fl/+; Spry4fl/+） 单细胞 RNA 测序中上皮细胞和成纤维细胞的分离及质量控制标准（基因数200-5900，线粒体基因<7%，核糖体基因<49%） MSF 亚群分选时使用的表面标志物（CD26、CD36、CD142）及流式抗体稀释度（1:100）
摘要
基质成纤维细胞是器官形成和癌症发展所必需的干细胞微环境的重要组成部分。单细胞技术的最新进展揭示的成纤维细胞异质性，提出了关于成纤维细胞亚型的起源、分化和功能的重要问题。在本研究中，我们发现在乳腺基质成纤维细胞中，由 Spry1、Spry2 和 Spry4 编码的受体酪氨酸激酶 (RTK) 负反馈调节因子的缺失，会导致多个 RTK 通路信号上调，并增加细胞外基质重塑，从而加速上皮分支。单细胞转录组分析表明，Spry 缺失导致的 FGF10 产生增加，源于一个功能独特的成纤维细胞亚群的扩张，该亚群具有最强的促分支能力。与其三个独立的谱系前体相比，该亚群中的成纤维细胞是“激活的”，因为它们紧邻正在积极分支和侵袭的上皮。在人类乳腺癌的三种主要亚型中，Spry 基因下调，激活的成纤维细胞扩增。总之，我们的数据强调了 Spry 基因对乳腺成纤维细胞功能亚型的调控及其在上皮形态发生和癌症发展中的重要作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Spry 基因（Spry1、Spry2、Spry4）在乳腺基质成纤维细胞中如何调控上皮分支形态发生，以及它们在乳腺癌发生中的作用是什么？
- 核心机制
- Spry 基因缺失导致 RTK（EGFR、IGFR 等）信号通路增强，促进 MSF-2 活化成纤维细胞亚群扩增，该亚群高表达 FGF10，从而通过旁分泌作用增强上皮 FGF 信号，加速上皮分支；此过程也促进乳腺癌发展。
- 主要证据
- 体外共培养实验显示 Spry1,2,4-KO 成纤维细胞显著促进类器官分支；体内 Spry-TKO 小鼠乳腺导管伸长和分支加速；单细胞 RNA 测序和磷酸化蛋白质组学分析显示 RTK 信号增强及 MSF-2 亚群比例增加；人类乳腺癌样本和 4T1 模型中观察到 Spry 下调及 MSF-2 亚群扩增。
- 研究意义
- 研究揭示了 Spry 基因调控乳腺成纤维细胞功能亚型及其在上皮形态发生和癌症发展中的关键作用，强调了理解不同成纤维细胞亚型功能对于开发针对肿瘤微环境的有效癌症疗法的重要性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内验证 Spry 缺失对乳腺发育的影响
验证 Fsp1-cre 介导的 Spry 基因敲除是否加速乳腺导管生长和分支。
使用 Fsp1-cre; Spry1Δ/fl; Spry2Δ/fl; Spry4Δ/fl (Spry-TKO) 小鼠及其对照同窝小鼠，通过 Carmine Red 染色比较 5周、7周和12周时第4对乳腺的导管延伸和分支点。
磷酸化蛋白质组学分析 RTK 信号通路
确定 Spry 缺失对成纤维细胞中 RTK 信号通路的影响。
对对照和 Spry1,2,4-KO 成纤维细胞进行磷酸化蛋白的质谱分析，并比较 ERBB、VEGFR 和 IGFR 家族信号活性。
单细胞转录组分析上皮和成纤维细胞
解析 Spry 缺失引起的上皮细胞和成纤维细胞的转录组变化。
从7周龄对照和 Spry-TKO 小鼠乳腺中分离上皮细胞和成纤维细胞，进行 scRNA-seq分析，包括 GSEA、GO 分析、CellChat 分析和 RNA velocity。
鉴定和验证 MSF 亚群及其功能
确定成纤维细胞亚群的特性及其在分支促进中的作用。
通过 UMAP 分析识别四个 MSF 亚群，利用 marker 基因和 FACS 分离亚群，验证 marker 表达，并进行共培养分支实验比较各亚群的促分支能力；同时验证亚群对 Erlotinib 的增殖反应。
分析人类乳腺癌和4T1模型中的 Spry 表达及 MSF 亚群
评估 Spry 基因和 MSF-2 亚群在乳腺癌中的变化。
利用 TCGA 数据库和公开的 scRNA-seq 数据（人类乳腺癌和4T1模型），分析 Spry1/2/4的表达及成纤维细胞亚群的大小。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
验证免疫效应
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12 培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Sigma | -- | |
| 胰岛素 | Sigma | -- | |
| 转铁蛋白 | -- | -- | |
| 硒 | -- | -- | |
| 基质胶 | Corning | -- | |
| I型胶原 | Corning | -- | |
| 胶原酶 | Sigma | -- | |
| 胰蛋白酶 | Life Technologies | -- | |
| 脱氧核糖核酸酶 I | -- | -- | |
| 药物处理 | 厄洛替尼 | -- | -- |
| 蛋白检测 | RIPA 裂解液 | Beyotime | P0013J |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | Bimake | B15001, | |
| BCA 蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | 23225 | |
| 预制胶 | Meilun | MA0295 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | WXBC3116V | |
| 显色底物 | Epizyme | SQ101L | |
| ERK1/2 抗体 | CST | 9102 | |
| 磷酸化 ERK1/2 抗体 | CST | 9101 | |
| GAPDH 抗体 | ABclonal | AC033 | |
| HRP 标记的山羊抗兔二抗 | CST | 7074S | |
| HRP 标记的山羊抗小鼠二抗 | CST | 7076S | |
| 流式分析 | 抗 CD31 抗体 | BioLegend | 102417 |
| 抗 Ter119 抗体 | BioLegend | 116221 | |
| 抗 CD45 抗体 | BioLegend | 100432 | |
| 抗 CD140a 抗体 | BioLegend | 135907 | |
| 抗 CD142 抗体 | Sino Biological | 50413-RP01 | |
| 抗 CD26 抗体 | BioLegend | 137804 | |
| 抗 CD36 抗体 | Thermo Fisher | 56-0362-82 | |
| RNA提取 | RNAqueous 试剂盒 | Life Technologies | -- |
| RNeasy Mini 试剂盒 | Qiagen | -- | |
| qPCR | TaqMan 逆转录试剂 | Life Technologies | -- |
| SYBR Green PCR 预混液 | Life Technologies | -- | |
| ABI 7900HT 实时荧光定量 PCR 系统 | Life Technologies | -- | |
| QuantStudio 12K Flex 实时荧光定量 PCR 系统 | Life Technologies | -- | |
| 细胞培养耗材 | 96孔低吸附板 | Corning | 3474 |
| 24孔板 | Thermo Fisher | 174930 | |
| 成像设备 | Leica M205 体视显微镜 | Leica | -- |
| Amersham Imager 680 成像系统 | GE Healthcare | -- | |
| SteREO Lumar V12 体视显微镜 | Zeiss | -- | |
| 流式细胞术 | BD Aria III 流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 动物实验 | 表达 Cre-GFP 的腺病毒 | Genkai Genetics | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外共培养分支实验 | 成纤维细胞与类器官比例（约1:100）、共培养时间（4天）、Matrigel 使用、成纤维细胞基因型（对照 vs Spry1,2,4-KO） 阅读提示：Methods: "Mammary epithelial organoids co-cultured with fibroblasts" |
| 体内乳腺发育分析 | 小鼠基因型（Spry-TKO vs 对照）、小鼠年龄（5、7、12周）、雌鼠发情状态、样本量（≥3只/基因型） 阅读提示：Results: "Loss of Spry1, Spry2, and Spry4 in mammary stromal fibroblasts causes accelerated epithelial branching" 和图1图例 |
| 单细胞 RNA 测序 | 小鼠年龄（7周）、每基因型小鼠数量（2只）、细胞质量控制标准（基因数、线粒体%）、分析流程 阅读提示：Methods: "Single cell RNA sequencing and bioinformatics analysis" |
| MSF 亚群分选与功能分析 | FACS 标志物（CD26、CD36、CD142）、抗体克隆号及稀释度、分选后验证 marker 表达、共培养分支条件 阅读提示：Methods: "FACS" 和 Results: "MSF-2 subgroup consists of activated fibroblasts" |
| Western blotting 验证 RTK 信号 | 血清饥饿时间（24小时）、刺激时间点、抗体稀释度、蛋白上样量 阅读提示：Methods: "Western blotting" |