鉴定ASC相互作用蛋白
鉴定与ASC结合的蛋白，以探索炎症小体激活的调控机制。
通过ASC免疫沉淀-质谱分析，在Francisella novicida感染的WT和Asc–/– BMDMs中鉴定NCF4/1/2为ASC结合蛋白。
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NCF4通过调节炎症小体激活和免疫监视减弱结直肠癌进展
NCF4 attenuates colorectal cancer progression by modulating inflammasome activation and immune surveillance.
实验完整度
高包含体外BMDM和HEK293T细胞实验、Ncf4基因敲除小鼠的AOM-DSS和ApcMin/+自发肿瘤模型、单细胞RNA测序及TCGA数据分析，并进行功能验证和机制验证。
主要模型
骨髓来源巨噬细胞（BMDM） HEK293T细胞 AOM-DSS诱导的结直肠癌小鼠模型 ApcMin/+自发结直肠癌小鼠模型
重点核对
NCF4与ASC的相互作用及其在NLRP3和AIM2炎症小体激活中的作用 NCF4磷酸化位点（T154A和S315A）对炎症小体激活和ASC斑点形成的影响 NCF4缺乏对AOM-DSS模型中肿瘤数量、大小、小鼠生存率和炎症小体相关细胞因子产生的影响 NCF4缺乏对结肠微环境中CD8+ T和NK细胞频率及IFN-γ产生的影响 NCF4在TCGA结直肠癌患者中的表达与五年生存率的相关性
摘要
炎症小体激活的时空调控仍不清楚。为了研究炎症小体反应组装和调控的机制，我们进行了含有CARD的凋亡相关斑点样蛋白（ASC）的免疫沉淀-质谱分析，并确定NCF4/1/2为ASC结合蛋白。NCF4表达的降低与结直肠癌的发展和患者五年生存率的降低相关。NCF4与NCF1和NCF2协同促进NLRP3和AIM2炎症小体的激活。机制上，NCF4的磷酸化和斑点分布从NADPH复合物切换到核周区域，介导ASC寡聚化、斑点形成和炎症小体激活。NCF4作为ROS水平的传感器，建立ROS产生和炎症小体激活之间的平衡。NCF4缺乏会导致小鼠严重结直肠癌，增加过渡放大细胞和癌前细胞，降低CD8+ T和NK细胞的频率和激活，并在结直肠肿瘤发生的早期阶段损害炎症小体-IL-18-IFN-γ轴。我们的研究暗示NCF4在决定炎症小体组装的空间定位和促进炎症小体介导的抗肿瘤反应中发挥作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- NCF4如何通过调控炎症小体激活和免疫监视来影响结直肠癌的进展？
- 核心机制
- NCF4在炎症小体激活时从NADPH氧化酶复合物转移到核周区域，与ASC结合并促进ASC寡聚化和斑点形成，从而激活NLRP3和AIM2炎症小体，并通过IL-18-IFN-γ轴增强CD8+ T和NK细胞的抗肿瘤免疫应答。
- 主要证据
- 免疫沉淀-质谱鉴定NCF4为ASC结合蛋白；Ncf4基因敲除小鼠在AOM-DSS模型中表现出更严重的肿瘤发展、降低的炎症小体激活和减少的CD8+ T和NK细胞浸润；单细胞RNA测序显示NCF4缺乏导致肠上皮细胞向癌前状态转变并减少免疫细胞相互作用；磷酸化突变体实验证明NCF4磷酸化对ASC寡聚化和炎症小体激活至关重要。
- 研究意义
- 研究揭示了NCF4作为ROS传感器和炎症小体组装的空间调节器，为理解NADPH氧化酶与炎症小体之间的相互调控提供了新机制，并可能为结直肠癌的免疫治疗提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证NCF4在炎症小体激活中的作用
确定NCF4及其同源蛋白NCF1和NCF2对NLRP3、AIM2和NLRC4炎症小体激活的必需性。
通过siRNA敲低和基因敲除小鼠BMDMs，检测不同炎症小体激活剂（LPS+ATP、dsDNA、F. novicida、沙门氏菌）处理后caspase-1激活和IL-1β释放。
评估NCF4对结直肠癌发展的影响
在体内模型中研究NCF4缺乏对结直肠癌发生和发展的影响。
使用AOM-DSS诱导的结直肠癌模型和ApcMin/+自发肿瘤模型，比较WT、Ncf4+/–和Ncf4–/–小鼠的肿瘤负担、生存率、组织病理和炎症小体相关细胞因子产生。
研究NCF4的亚细胞定位和ASC斑点形成
阐明NCF4如何引导ASC斑点的形成和炎症小体的组装。
通过共聚焦显微镜和共免疫沉淀分析NCF4、NCF1、NCF2、NLRP3和ASC在炎症小体激活时的细胞内定位和相互作用。
确定NCF4磷酸化在炎症小体激活中的作用
验证NCF4的磷酸化对其在炎症小体激活中功能的重要性。
使用PKC抑制剂PKC412和NCF4磷酸化位点突变体（S85N, T154A, T216M, S315A和NCF4MT）进行功能实验，检测caspase-1激活、IL-1β分泌、ASC寡聚化和斑点形成。
分析NCF4在肿瘤免疫监视中的作用
确定NCF4调节的炎症小体激活是否影响早期结直肠癌发生过程中的肿瘤免疫微环境。
在AOM-DSS模型第35天，对WT和Ncf4–/–小鼠结肠组织进行单细胞RNA测序，分析细胞组成、发育轨迹和细胞-细胞相互作用，并通过流式细胞术验证免疫细胞变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F-12培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| L929细胞条件培养基 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 非必需氨基酸 | -- | -- | |
| 转染 | Neon转染系统 | Invitrogen | MPK10025 |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 化学抑制剂 | N-乙酰半胱氨酸 | Sigma | A9165 |
| 米哚妥林 | MedChemexpress | 120685 | |
| 二苯基氯化碘盐 | MedChemexpress | HY-100965 | |
| 夹竹桃麻素 | MedChemexpress | HY-N0088 | |
| 药物处理 | 氧化偶氮甲烷 | Sigma | A5486 |
| 葡聚糖硫酸钠 | MP Biomedicals | 9011181 | |
| 重组小鼠IL-18 | Sino Biological | 50073-MNCE | |
| Western blot | 抗ASC抗体 | AdipoGen | AG-25B-0006 |
| 抗caspase-1抗体 | AdipoGen | AG-20B-0042 | |
| 抗NCF4抗体 | Abcam | ab76158 | |
| 抗NCF1抗体 | Abcam | ab166930 | |
| 抗NCF2抗体 | Abcam | ab109366 | |
| 抗磷酸化NCF4抗体 | Cell Signaling Technology | 4311 | |
| 抗NOX2抗体 | Abcam | ab129068 | |
| 抗FLAG抗体 | Sigma | F3165 | |
| 抗Myc抗体 | Cell Signaling Technology | 2278 | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 5174 | |
| HRP标记二抗 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 免疫荧光 | 抗NLRP3抗体 | AdipoGen | AG-20B-0014 |
| 鬼笔环肽 | Invitrogen | A22287 | |
| Alexa Fluor 488二抗 | Invitrogen | A-11008 | |
| Alexa Fluor 555二抗 | Invitrogen | A-21422 | |
| 封片剂 | Vector Laboratories | H-1200 | |
| 免疫共沉淀 | 蛋白A/G琼脂糖珠 | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 |
| 单细胞分离 | 胶原酶 | Sangon Biotech | A004202 |
| DNA酶I | Diamond | B002004-0005 | |
| Percoll分离液 | -- | -- | |
| 单细胞测序 | 单细胞3' RNA试剂盒 | 10x Genomics | -- |
| 流式分析 | DCFDA荧光探针 | Sigma-Aldrich | 287810 |
| BD LSR Fortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| ELISA | 小鼠IL-1β ELISA试剂盒 | BioLegend | 432601 |
| 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | BioLegend | 431301 | |
| 小鼠TNF ELISA试剂盒 | BioLegend | 430901 | |
| 小鼠IL-18 ELISA试剂盒 | Beyotime Biotechnology | PI553 | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| M-MLV逆转录酶 | Promega | -- | |
| 罗氏LightCycler 96实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| 显微镜 | 蔡司LSM880共聚焦显微镜 | ZEISS | -- |
| ANDOR高速共聚焦显微镜 | ANDOR | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| BMDM制备与处理 | 骨髓细胞在L929条件培养基中培养5天；LPS浓度500 ng/mL处理4小时；ATP浓度5 mM处理15-60分钟；dsDNA转染1.5 μg；F. novicida感染MOI 100或200；沙门氏菌感染MOI 3 阅读提示：Methods部分 'Preparation of BMDMs, treatment, bacterial infection, and siRNA transfection' |
| NCF4基因敲除小鼠生成 | Ncf4基因外显子2-7被CRISPR-Cas9敲除；小鼠回交C57BL/6背景九代 阅读提示：Methods部分 'Mice' |
| AOM-DSS结直肠癌模型 | AOM剂量10 mg/kg腹腔注射；DSS浓度1.5%~2%饮水处理；DSS处理周期（6天DSS+2周水，重复3次）；第70天分析肿瘤 阅读提示：Methods部分 'AOM-DSS model of colorectal tumorigenesis' |
| NCF4磷酸化突变体实验 | NCF4磷酸化位点突变体（T154A, S315A）功能缺失；PKC抑制剂PKC412浓度25-100 nM 阅读提示：Results部分 'Phosphorylation of NCF4 is essential for inflammasome activation' 和对应的图和图注 |
| 单细胞RNA测序 | 小鼠在AOM处理后第35天取样；使用10x Genomics平台；数据处理参数（基因数200-7000，线粒体基因比例<0.7） 阅读提示：Methods部分 'Single-cell isolation from fresh colon tissues' 和 'Single-cell RNA sequencing analysis' |