RUBY格式设计
设计并选择最优的突变组合以实现链的正确配对并降低免疫原性风险。
基于IgG结构，设计了20种不同突变组合的变体，在VH-CH1和VL-CL界面引入突变。通过瞬转表达和蛋白A纯化评估各变体的产量和HMWs水平，并结合免疫原性预测选择变体9。进一步引入去免疫突变，通过MAPPs和MHC II结合预测确认。
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RUBY®——一种具有优异功能性和IgG样稳定性、药理学及可开发性的四价(2+2)双特异性抗体形式
RUBY® - a tetravalent (2+2) bispecific antibody format with excellent functionality and IgG-like stability, pharmacology and developability properties.
实验完整度
高包含瞬转/稳转表达、多种稳定性评估、FcγR/FcRn结合、体外功能（报告基因/细胞因子释放）、小鼠/非人灵长类PK及肿瘤定位等多层级实验验证。
主要模型
Expi293 HEK细胞瞬转系统 CHOZn稳定细胞系（CHOZn-GS） C57BL/6小鼠 人CD40转基因小鼠 食蟹猴 MB49肿瘤模型小鼠
重点核对
稳定细胞系选择：CHOZn-GS，使用潮霉素和嘌呤霉素筛选，单克隆化后评估表达滴度和质量 瞬转表达：Expi293和ExpiCHO系统，体积范围600μL至2L PK评估：小鼠静脉注射剂量（RUBY 167μg vs mAb 100μg；CD40-TAA RUBY 360μg vs CD40 mAb 216μg），采血时间点 肿瘤定位：MB49-hEpCAM小鼠模型，RUBY 333μg vs mAb 200μg，注射后24小时分析 FcγR和FcRn结合分析：BLI测定，使用特定FcγR和FcRn重组蛋白
摘要
尽管存在大量双特异性抗体(bsAb)形式，新型bsAb的生成仍然面临开发和生物加工方面的挑战。在此，我们介绍了RUBY，一种新型双特异性抗体形式，能够快速生成满足关键开发标准的bsAb。RUBYTM形式具有2+2几何结构，其中两个Fab片段通过其轻链连接到IgG的C末端，并携带用于优化链配对的突变。这种独特的设计使得生成的bsAb具有类似mAb的属性。我们的数据表明，RUBY bsAb与用于筛选目的的小规模生产系统兼容，并且可以从稳定细胞系中以高产量(>3克/升)生产。所生产的bsAb通常含有低水平的聚集体，并表现出良好的溶解性和应激耐受性。此外，显示了与各种IgG同种型的兼容性，并确认了定制的Fcγ受体结合。还证明了与FcRn的保留相互作用转化为在小鼠和非人灵长类动物中与mAb对照相当的药代动力学特征。条件性激活的RUBY bsAb的功能已在体外得到证实。体内抗肿瘤作用先前已被证明，并显示出优于可比mAb的效果，此处进一步显示RUBY bsAb在体内能够渗透并定位到肿瘤组织。总之，RUBY形式具有吸引人的mAb样属性，并提供了减轻与其他bsAb形式相关的许多开发挑战的可能性，促进了高功能性和可开发性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何设计一种新型双特异性抗体格式，使其兼具类似单克隆抗体的稳定性、可制造性、药代动力学特性和功能性？
- 核心机制
- RUBY格式通过2+2几何结构（两个Fab经轻链连接至IgG C端）和界面突变优化链配对，实现双靶点二价结合，保留Fc介导的效应功能和FcRn介导的循环半衰期。
- 主要证据
- 多种RUBY bsAb的体外功能实验（CD40报告基因、T细胞活化）、PK研究（小鼠/非人灵长类）、肿瘤定位实验和稳定性评估共同支持结论。
- 研究意义
- RUBY格式提供了一种可开发性强、具备mAb样属性的双特异性抗体平台，有望简化开发流程并应用于肿瘤免疫治疗等领域。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
生产可行性评估
验证RUBY bsAb在瞬转和稳定细胞系中的表达产量和质量。
在96孔板Expi293系统中瞬转表达150种RUBY bsAbs，评估产量。使用CHOZn细胞进行稳定转染（三质粒共转），经筛选和单克隆化后评估Fed-batch产量（深层培养和摇瓶培养）。
稳定性与可开发性评估
评估RUBY bsAb的热稳定性、剪切应力、胶体稳定性、冻融、血清、低pH等稳定性。
进行多种稳定性实验：热稳定性测定Tm、剪切应力、胶体稳定性（PEG沉淀）、血清稳定性、冻融、低pH孵育以及不同缓冲液配方下的长期稳定性。通过SEC-HPLC、SDS-PAGE、双ELISA等分析降解。
体外功能验证
验证RUBY bsAb的双靶点结合、条件性激活和T细胞激活功能。
通过双ELISA验证同时结合两个靶点；使用CD40报告基因细胞验证CD40-EpCAM RUBY的条件性激活；使用人CD8+ T细胞验证CD137-5T4 RUBY的T细胞活化。
Fc受体结合评估
评估RUBY bsAb与FcγR和FcRn的结合能力，比较不同同种型。
通过BLI测量RUBY bsAbs（IgG1、IgG1 LALA、IgG2）对一系列人源和小鼠Fcγ受体以及人/鼠FcRn的结合动力学。
体内药代动力学和肿瘤定位评估
评估RUBY bsAb在体内的药代动力学特性和肿瘤靶向能力。
在C57BL/6小鼠、人CD40转基因小鼠和食蟹猴中评估RUBY bsAbs的PK曲线。使用ELISA检测血清浓度和完整分子比例。在MB49肿瘤模型小鼠中评估RUBY bsAb的肿瘤定位。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证免疫效应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与转染 | Expi293 | Life Technologies | -- |
| ExpiCHO | -- | -- | |
| 稳定细胞系开发 | CHOZn-GS | Merck-SAFC | -- |
| 单细胞克隆 | 单细胞打印机 | Cytena | -- |
| 细胞计数与活率分析 | ViCellXR | Beckman Coulter | -- |
| 蛋白纯化 | NGC系统 | BioRad | -- |
| ÄKTA Avant系统 | GE Healthcare | -- | |
| Predictor MabSelectSure 50 µL 96孔板 | GE Healthcare | -- | |
| 蛋白分析 | 1260 Infinity II高效液相色谱系统 | Agilent Technologies | -- |
| Caliper GXII | -- | -- | |
| Octet RED96 | Sartorius | -- | |
| 双ELISA | 人5T4蛋白 | Innovagen | ID95677.07 |
| 人CD40蛋白 | R&D Systems | 1493-CD | |
| 生物素化CD137 | -- | -- | |
| 生物素化EpCAM | SinoBiological | 10694 H02H-B | |
| 辣根过氧化物酶标记链霉亲和素 | Pierce | 21126 | |
| SuperSignal Pico发光底物 | Thermo Fischer Scientific | 37069 | |
| Fluostar Optima | BMG Labtech | -- | |
| FcγR结合 | 人FcγRI | R&D Systems | 1257-FC-050 |
| 人FcγRIIa | R&D Systems | 1330-CD-050 | |
| 人FcγRIIb | R&D Systems | 1875-CD-050 | |
| 人FcγRIIIa | R&D Systems | 4325-FC-050 | |
| 人FcγRIIIa V176F变体 | R&D Systems | 8894-FC-050 | |
| 小鼠FcγRI | R&D Systems | 2074-FC-050 | |
| 小鼠FcγRIIb | R&D Systems | 1460-CD-050 | |
| 小鼠FcγRIII | R&D Systems | 1960-FC-050 | |
| 小鼠FcγRIV | Sino Biologicals | 50036-M27H-50 | |
| FcRn结合 | 人FcRn | Immunitrack | ITF02-200 |
| 小鼠FcRn | R&D Systems | 6775-FC-050 | |
| 热稳定性 | UNcle系统 | UNchained labs | -- |
| 剪切应力稳定性 | MixMate混匀器 | Eppendorf | -- |
| CLARIOstar酶标仪 | BMG LabTech | -- | |
| 胶体稳定性 | 聚乙二醇8000 | AppliChem | P0E040A |
| 血清稳定性 | 人血清 | Sigma | H4522 |
| 溶解性 | Vivaspin 6超滤离心管 | GE Healthcare | -- |
| 报告基因实验 | CD40生物测定 | Promega | -- |
| Bio-Glo试剂 | Promega | -- | |
| T细胞活化实验 | Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 |
| CD8+ T细胞分离试剂盒 | Miltenyi | 130-096-495 | |
| 抗CD3抗体(OKT3) | Affymetrix eBioscience | 16-0037-85 | |
| 5T4-Fc融合蛋白 | Innovagen | ID95677.07 | |
| RPMI培养基 | Gibco | 61870010 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10270-106 | |
| HEPES缓冲液 | Gibco | 15630056 | |
| IFN-γ ELISA试剂盒 | BD OptiEIA | 555142 | |
| PK实验 | 抗人IgG重链抗体 | Thermo Fisher Scientific | 31118 |
| HRP标记抗人IgG kappa轻链抗体 | Bio-Rad | STAR127P | |
| 小鼠Fc融合人CD40 | Ancell | 504-820 | |
| HRP标记山羊抗人IgG1 Fc抗体 | Jackson ImmunoResearch | 109-035-098 | |
| 生物素化人Fc融合人EpCAM | Sino Biological | 10694-H02H-B | |
| SuperSignal化学发光底物 | Thermo Scientific | 37069 | |
| Fluostar Optima | BMG | -- | |
| Clariostar酶标仪 | BMG Labtech | -- | |
| 人CEACAM5蛋白 | R&D systems | 4128 CM | |
| 生物素化CD40 | Ancell | 504-030 | |
| HRP标记链霉亲和素 | Pierce | 21126 | |
| 白色高结合力微孔板 | Greiner | -- | |
| 肿瘤定位 | MB49膀胱癌细胞 | Millipore | -- |
| Liberase TL消化酶 | Roche | 05401020001 | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Roche | 10104159001 | |
| 小鼠BD Fc阻断剂 | BD Biosciences | 553142 | |
| 抗小鼠CD45-PerCP-Cy5.5抗体 | BD Biosciences | 550994 | |
| 抗人IgG-PE抗体 | Jackson ImmunoResearch | 109-115-098 | |
| FVS450活力染料 | BD Biosciences | 562247 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 分析软件 | FlowJo软件 | BD Biosciences | -- |
| GraphPad Prism软件 | GraphPad software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 瞬转表达 | 宿主细胞系（Expi293、ExpiCHO）、转染质粒比例、培养体积、产量标准（>30 mg/L） 阅读提示：Materials and Methods: Manufacturability in transient cultures |
| 稳定细胞系开发 | CHOZn-GS平台、筛选标记（潮霉素、嘌呤霉素）、筛选时间（3周）、单克隆化方法、Fed-batch培养时间（14天） 阅读提示：Materials and Methods: Generation of stable CHO production cell lines |
| 稳定性评估 | 蛋白浓度、缓冲液（PBS或特定配方）、温度（2-8°C, RT, 40°C）、时间（1-4周）、冻融轮次、检测方法（SEC-HPLC、SDS-PAGE、ELISA） 阅读提示：Materials and Methods: Temperature stability, Shear stress stability, Colloidal stability, Low pH stability, Serum stability |
| Fc受体结合分析 | BLI平台（Octet）、抗体捕获方式、FcγR/FcRn浓度范围、结合和解离时间 阅读提示：Materials and Methods: Octet, Binding to Fcγ receptors, Binding to Fc neonatal receptors |
| 体外功能实验 | 报告基因实验：细胞数量、刺激条件；T细胞活化：PBMC来源、CD8+ T细胞富集、包被抗体浓度、共培养时间、检测指标（IFN-γ） 阅读提示：Materials and Methods: Reporter assays, T cell activation assay |
| 体内PK和肿瘤定位实验 | 动物品系和数量、给药剂量和途径、采血时间点、分析ELISA方法 阅读提示：Materials and Methods: PK assessment in mice, PK assessment in non-human primates, Tumor localization |