Human coronavirus OC43-elicited CD4+ T cells protect against SARS-CoV-2 in HLA transgenic mice.
包含DNA疫苗免疫、SARS-CoV-2感染、OC43序贯感染、肽免疫、T细胞耗竭等体内外实验，并进行了ELISpot、ICS、RT-qPCR、组织病理学等功能和机制验证。
HLA-B*0702 Ifnar1-/-转基因小鼠 HLA-DRB1*0101 Ifnar1-/-转基因小鼠 SARS-CoV-2 B.1.351感染模型 SARS-CoV-2 MA10感染模型
HLA转基因小鼠品系（HLA-B*0702或HLA-DRB1*0101，并敲除I型干扰素受体） OC43感染剂量：109基因组当量，鼻内接种 SARS-CoV-2挑战剂量：B.1.351为105 PFU，MA10为104 PFU，鼻内接种 OC43与SARS-CoV-2挑战之间的间隔：HLA-DRB1*0101小鼠为16天，HLA-B*0702小鼠为60-70天 CD4+ T细胞耗竭抗体（克隆GK1.5）在挑战前连续3天腹腔注射，每天250 μg
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确定HLA-B*0702和HLA-DRB1*0101背景下SARS-CoV-2 S、M、N蛋白的免疫优势CD8+和CD4+ T细胞表位。
使用IEDB预测HLA-B*0702限制性CD8+ T细胞表位（69个肽）和HLA-DRB1*0101限制性CD4+ T细胞表位（42个肽）。用编码SARS-CoV-2 S、M或N蛋白的DNA疫苗免疫小鼠，通过ELISpot和ICS检测脾细胞和肺白细胞对肽的IFNγ响应。
验证DNA疫苗诱导的表位是否也能在SARS-CoV-2感染中产生类似的T细胞反应。
用SARS-CoV-2 B.1.351感染HLA-B*0702小鼠，用MA10感染HLA-DRB1*0101小鼠，8天后收集脾细胞，用肽刺激后通过ICS分析CD8+和CD4+ T细胞反应。
确定OC43感染是否诱导与SARS-CoV-2肽交叉反应的CD8+和CD4+ T细胞。
用OC43感染HLA转基因小鼠，在感染后不同时间点（1-30天）收集脾细胞和肺白细胞，用SARS-CoV-2肽库刺激，通过ELISpot和ICS分析T细胞反应。
测试针对免疫优势CD8+ T细胞表位的免疫是否能保护SARS-CoV-2感染和肺损伤。
用SARS-CoV-2 N104-113肽（用CFA/IFA佐剂）免疫HLA-B*0702小鼠，然后用SARS-CoV-2 B.1.351或MA10挑战，3天后分析病毒载量和肺组织病理学。
在HLA转基因小鼠中，评估OC43预暴露对随后SARS-CoV-2感染和肺损伤的影响。
HLA转基因小鼠先感染OC43，然后在不同时间点（8、16、60-70天）用SARS-CoV-2挑战，3天后分析病毒载量和肺组织病理学。部分实验用抗CD4抗体耗竭CD4+ T细胞。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 疫苗接种 | BTX Agile Pulse系统 | BTX | 47-0500N |
| 针阵列 | BTX | 47-0045 | |
| 完全弗氏佐剂 | -- | -- | |
| 不完全弗氏佐剂 | -- | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| RPMI培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| HEPES缓冲液 | -- | -- | |
| 转染 | Opti-MEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 免疫荧光 | Cytofix固定液 | BD Biosciences | -- |
| Triton X-100 | -- | -- | |
| 皂苷 | -- | -- | |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| 抗S蛋白抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA5-35946 | |
| 抗N蛋白抗体 | Absolute Antibody | Ab01691-3 | |
| 抗M蛋白抗体 | Prosci | 9157 | |
| Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
| ProLong Gold抗淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 显微镜 | Keyence BZ-X810荧光显微镜 | Keyence | -- |
| 流式细胞术 | Cytofix/Cytoperm固定/透化试剂盒 | BD Biosciences | -- |
| LSR II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| FlowJo软件 | -- | -- | |
| 病毒繁殖 | HCT-8细胞系 | -- | -- |
| 病毒浓缩 | Amicon Ultra-15离心过滤装置 | Millipore Sigma | UFC9100 |
| 病毒定量 | qScript一步法qRT-PCR试剂盒 | Quantabio | -- |
| 病毒繁殖 | Vero细胞 | ATCC | CCL81 |
| 杜氏改良Eagle培养基 | Corning | -- | |
| 病毒滴度 | 羧甲基纤维素 | -- | -- |
| 结晶紫 | -- | -- | |
| RNA提取 | RNA/DNA保护液 | ZYMO Research | R1100-250 |
| RNeasy小型RNA提取试剂盒 | QIAGEN | -- | |
| Tissue Lyser II组织研磨仪 | QIAGEN | -- | |
| RLT裂解缓冲液 | QIAGEN | -- | |
| 重组蛋白生产 | HEK-293F细胞系 | -- | -- |
| PEI-MAX转染试剂 | Polysciences | -- | |
| 重组蛋白纯化 | Biolock试剂 | IBA Lifesciences | 2-0205-050 |
| Strep-Tactin柱 | IBA Lifesciences | -- | |
| AKTA纯化系统 | GE Healthcare | -- | |
| HRV-3C蛋白酶 | -- | -- | |
| Superose S6 Increase分子筛柱 | GE Healthcare | -- | |
| Vivaspin 500-10K超滤管 | Sartorius | -- | |
| 重组蛋白生产 | pET46载体 | Novagen | -- |
| Rosetta2 pLysS大肠杆菌 | Novagen | -- | |
| 氯霉素 | -- | -- | |
| 异丙基硫代半乳糖苷 | -- | -- | |
| 苯zonase核酸酶 | Biotool | B16012 | |
| 重组蛋白纯化 | 镍-次氮基三乙酸珠 | -- | -- |
| TEV蛋白酶 | -- | -- | |
| ELISA | 重组OC43 S蛋白 | Sino Biological | 40607-V08B |
| 印迹级酪蛋白 | Bio-Rad | -- | |
| 吐温-20 | -- | -- | |
| 辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG抗体 | Jackson ImmunoResearch | -- | |
| TMB底物 | Pierce | -- | |
| 硫酸 | Fisher Chemical | -- | |
| SpectraMax M2酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| 流式细胞术 | I型胶原酶 | Worthington | -- |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞分离 | gentleMACS Octo组织解离器 | Miltenyi Biotec | -- |
| 70μm细胞筛网 | -- | -- | |
| ACK裂解缓冲液 | Gibco | -- | |
| 流式细胞术 | 布雷菲德菌素A | BioLegend | -- |
| 大鼠抗小鼠CD107a抗体 | BioLegend | 克隆1D4B | |
| 细胞刺激混合物 | eBioscience | -- | |
| eFluor 455 UV活力染料 | Invitrogen | -- | |
| 抗小鼠CD3ε抗体 | Tonbo | 克隆145-2C11 | |
| 抗小鼠CD8α抗体 | BioLegend | 克隆53-6.7 | |
| 抗小鼠CD4抗体 | eBioscience | 克隆GK1.5 | |
| 抗小鼠CD44抗体 | BioLegend | 克隆IM7 | |
| 抗小鼠CD62L抗体 | BioLegend | 克隆MFL-14 | |
| 抗小鼠IFNγ抗体 | Tonbo | 克隆XMG1.2 | |
| 抗小鼠TNFα抗体 | eBioscience | 克隆MP6-XT22 | |
| 抗小鼠IL-2抗体 | BioLegend | 克隆JES6-5H4 | |
| 抗小鼠CD107a抗体 | BioLegend | 克隆1D4B | |
| 抗小鼠IL-4抗体 | BioLegend | 克隆11B11 | |
| 抗小鼠IL-17A抗体 | BioLegend | 克隆TC11-18H10.1 | |
| LSR Fortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| ELISpot | Immobilon-P膜 | Millipore | -- |
| 抗小鼠IFNγ抗体 | Mabtech | 克隆AN18 | |
| ELISpot读板仪 | MABTech | -- | |
| CD4+ T细胞清除 | CD4+ T细胞清除抗体 | BioXCell | 克隆GK1.5 |
| 大鼠IgG2同型对照抗体 | BioXCell | 克隆LTF-2 | |
| 肽合成 | TC Peptide Lab | TC Peptide Lab | -- |
| 组织病理学 | 锌福尔马林 | -- | -- |
| Leica ST5020自动染色机 | Leica | -- | |
| Zeiss AxioScan Z1扫描仪 | Zeiss | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型 | HLA-B*0702或HLA-DRB1*0101转基因且Ifnar1-/-的小鼠，5-7周龄，性别比例约1:1 阅读提示：Methods：Mice |
| 病毒株和感染剂量 | OC43（ATCC VR-1558）：109 GE，鼻内接种；SARS-CoV-2 MA10：104 PFU；B.1.351：105 PFU，鼻内接种 阅读提示：Methods：Vaccination and infection |
| 免疫方案 | DNA疫苗剂量25 μg，肌内电穿孔，第0天和14天；N104-113肽250 μg，CFA/IFA佐剂，第0天和21天 阅读提示：Methods：Vaccination and infection |
| 序贯感染间隔 | HLA-DRB1*0101小鼠：OC43感染后16天挑战SARS-CoV-2；HLA-B*0702小鼠：60-70天 阅读提示：Results：OC43 infection confers cross-protection…；Methods |
| CD4+ T细胞清除 | 抗CD4抗体（克隆GK1.5）或同型对照（克隆LTF-2）250 μg，腹腔注射，挑战前3天每天一次 阅读提示：Methods：CD4+ T cell depletion |
