从SARS-CoV-2奥密克戎变异株感染康复者中快速分离泛中和抗体

Rapid isolation of pan-neutralizing antibodies against Omicron variants from convalescent individuals infected with SARS-CoV-2.

作者信息Peng Yu, Jingping Ran, Ruiqi Yang, Hang Zhu, Song Lu, Yuzhang Wu, Tingting Zhao, Tianchen Xiong
PMID38510237
发布时间2024-03-06
DOI10.3389/fimmu.2024.1374913

实验完整度

中

包含患者样本、细胞实验,以及ELISA、SPR、假病毒中和等体外功能验证,但未进行动物实验或体内验证,且样本量小。

主要模型

Omicron感染康复者外周血单个核细胞(PBMC) RBD特异性记忆B细胞 HEK293F细胞(抗体表达) 293T/ACE2细胞(假病毒中和实验)

重点核对

供者样本来源:Omicron感染康复者(供者3、7)和健康对照(供者4、5),症状发作后约50天采集血液 细胞分选:CD19+IgM-IgD-7-AAD-门控的记忆B细胞,基于BA.4/5 RBD抗原结合 Beacon筛选:41246个单B细胞中鉴定出137个RBD反应性细胞,其中4个具hACE2阻断活性 假病毒中和:对BA.4/5、XBB.1.5、XBB.1.16、EG.5.1的IC50值范围,2173-A6为0.134-0.29 μg/ml,3462-A4为0.117-0.22 μg/ml 竞争ELISA:2173-A6和3462-A4识别相同或重叠表位

摘要

Introduction: The emergence of SARS-CoV-2 Omicron subvariants has presented a significant challenge to global health, as these variants show resistance to most antibodies developed early in the pandemic. Therapeutic antibodies with potent efficacy to the Omicron variants are urgently demanded.Methods: Utilizing the rapid antibody discovery platform, Berkeley Lights Beacon, we isolated two monoclonal neutralizing antibodies, 2173-A6 and 3462-A4. These antibodies were isolated from individuals who recently recovered from Omicron infections.Results: Both antibodies, 2173-A6 and 3462-A4, demonstrated high affinity for the RBD and effectively neutralized pseudoviruses from various Omicron lineages, including BA.4/5, XBB.1.16, XBB.1.5, and EG.5.1. This neutralization was achieved through binding to identical or overlapping epitopes.Discussion: The use of the Beacon platform enabled the rapid isolation and identification of effective neutralizing antibodies within less than 10 days. This process significantly accelerates the development of novel therapeutic antibodies, potentially reducing the time required to respond to unknown infectious diseases in the future.

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
如何快速分离有效中和Omicron变异株的单克隆抗体?
核心机制
2173-A6和3462-A4通过结合RBD上相同或重叠的表位,阻断RBD与hACE2受体的相互作用,从而中和多种Omicron亚型假病毒。
主要证据
从Omicron感染康复者血液中分选RBD特异性记忆B细胞,经Beacon平台筛选和抗体基因克隆,得到两株抗体;ELISA、SPR显示其与多种Omicron RBD结合;假病毒中和实验显示对BA.4/5、XBB.1.5、XBB.1.16和EG.5.1的强中和活性(IC50 < 0.3 μg/ml),但对野生型无效。
研究意义
Beacon平台可在10天内完成中和抗体筛选,显著加速新型治疗性抗体的开发,有助于应对新发传染病。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

供者样本收集与血清学评估

评估康复者血清对Omicron BA.4/5 S蛋白和RBD的结合及阻断hACE2结合的能力,以筛选有中和活性的供者。

采集5名Omicron感染康复者和2名健康对照的血液,分离PBMC;ELISA检测血清与BA.4/5 S蛋白、RBD的结合,并检测血清对RBD-hACE2结合的抑制。

2

RBD特异性记忆B细胞富集与分选

从候选供者的PBMC中富集并分选识别RBD的类别转换记忆B细胞,为后续单细胞筛选做准备。

使用免疫磁珠负选法分离B细胞,经抗体染色和流式分选获得CD19+IgD-IgM-RBD+细胞,并在扩增培养基中活化培养8天。

3

Beacon单细胞功能性筛选

在Beacon平台上高通量筛选分泌RBD结合抗体和阻断RBD-hACE2相互作用的单B细胞。

将活化B细胞加载到OptoSelect 11k芯片,通过OEP技术将单个细胞置于NanoPens;进行两个连续实验:RBD结合检测和hACE2阻断检测;鉴定阳性细胞并从芯片导出。

4

单B细胞抗体基因序列分析

从导出细胞中扩增并测序抗体VH和VL基因,用于重组抗体表达。

使用Opto Plasma B Discovery cDNA Synthesis Kit进行逆转录和cDNA扩增,Sanger测序,Geneious Biologics分析抗体序列。

5

重组抗体的表达与纯化

在HEK293F细胞中表达纯化重组单克隆抗体,用于后续功能实验。

将重链和轻链基因克隆到pcDNA3.4载体,共转染HEK293F细胞,培养5天后收集上清,Protein A柱纯化,SDS-PAGE验证。

6

抗体结合活性与亲和力测定

检测抗体对各Omicron亚型RBD的结合活性和亲和力。

ELISA检测抗体与BA.4/5、XBB.1.5、XBB.1.16、EG.5.1 RBD的结合;SPR测定亲和动力学。

7

假病毒中和实验

评估抗体对多种SARS-CoV-2假病毒的中和能力。

将抗体与假病毒共孵育,加入293T/ACE2细胞,16小时后检测荧光素酶活性,计算IC50。

8

表位竞争分析

确定两株抗体的表位是否相同或重叠。

竞争ELISA:将RBD与一株抗体预孵育后,检测其与另一株抗体的结合变化;同时比较非中和抗体2479作为对照。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
OPM-293 CD05培养基Opmbiosciences81075-001
KOP293表达培养基KairuibiotechK03252
KPM无血清培养基KairuibiotechK03125
Ficoll分离液Cytiva10308255
无血清冻存液PricellaPB180438
EasySep人B细胞富集试剂盒STEMCELL17954
ImmunoCult人B细胞扩增试剂盒STEMCELL1000645
抗CD19-APC抗体BioLegend302212
抗IgD-FITC抗体BioLegend348206
抗IgM-FITC抗体BioLegend314506
7-AAD染色液Invitrogen00699342
PE标记链霉亲和素偶联物BioLegend127807
BD FACSAira Fusion流式细胞分选仪BD Biosciences--
OptoSelect 11k芯片Berkeley Lights--
链霉亲和素包被的检测珠Berkeley Lights520-00053
AF568标记抗人IgG二抗Thermo FisherA-21090
AF647标记hACE2Thermo FisherA330009
裂解缓冲液Qiagen1070498
Opto Plasma B Discovery cDNA合成试剂盒Berkeley Lights750-02030
Agencourt RNAClean XP磁珠Beckman CoulterA63987
Agencourt AMPure XP磁珠Beckman CoulterA63881
Opto Plasma B Discovery Sanger测序准备试剂盒Berkeley Lights750-02041
pcDNA3.4 TOPO载体Thermo FisherA14697
TA293转染试剂KairuibiotechK20001
Protein A亲和层析柱Smart LifesciencesSA012100
ÄKTA pure 150蛋白质纯化系统Cytiva--
30kDa截留分子量超滤离心管MilliporeUFC903024
酶标板LABSELECT31111
HRP标记山羊抗人IgG (H+L)抗体ABclonalAS003
TMB底物BeyotimeP0209
HRP标记链霉亲和素BeyotimeA0303
EZ-Link NHS-PEG4-生物素试剂盒Thermo Fisher ScientificA39259
Octet RH96系统Sartorius--
Protein A生物传感器 (Octet AHC2)Sartorius18-5142
96孔板Corning3599
荧光素酶报告基因检测试剂盒VazymeDD1201
ACE2蛋白Sino Biological10108-H08H
Spike (BA.4/5) S1+S2三聚体蛋白Sino Biological40589-V08H32
Spike RBD BA.4/5蛋白Sino Biological40592-V08H130
Spike RBD XBB.1.5蛋白Sino Biological40592-V08H146
Spike RBD XBB.1.16蛋白Sino Biological40592-V08H136
Spike RBD EG.5.1蛋白Sino Biological40592-V08H151
假病毒(野生型和变异株)Vazyme--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
样本收集
供者来源、康复期时间、采集设备
阅读提示:Materials and Methods - Human sample collection
B细胞分选
B细胞分离方法、抗体panel、分选门控、培养时间
阅读提示:Materials and Methods - RBD-specific memory B cells enrichment and plasmablast activation
Beacon筛选
芯片型号、细胞数量、检测珠制备、荧光标记抗体浓度、筛选标准
阅读提示:Materials and Methods - Single RBD-specific ASCs selection by Berkeley lights Beacon system; Figure 2
抗体表达与纯化
表达载体、转染细胞系、转染试剂、纯化方法、缓冲液pH
阅读提示:Materials and Methods - MAbs expression and purification
结合与亲和力
ELISA包被抗原、抗体浓度、SPR传感器、分析软件
阅读提示:Materials and Methods - Binding affinity measurement; Figure 3
中和实验
细胞系、细胞密度、假病毒来源、孵育时间、检测试剂
阅读提示:Materials and Methods - Pseudoviruses neutralization assay; Figure 4