供者样本收集与血清学评估
评估康复者血清对Omicron BA.4/5 S蛋白和RBD的结合及阻断hACE2结合的能力,以筛选有中和活性的供者。
采集5名Omicron感染康复者和2名健康对照的血液,分离PBMC;ELISA检测血清与BA.4/5 S蛋白、RBD的结合,并检测血清对RBD-hACE2结合的抑制。
Rapid isolation of pan-neutralizing antibodies against Omicron variants from convalescent individuals infected with SARS-CoV-2.
包含患者样本、细胞实验,以及ELISA、SPR、假病毒中和等体外功能验证,但未进行动物实验或体内验证,且样本量小。
Omicron感染康复者外周血单个核细胞(PBMC) RBD特异性记忆B细胞 HEK293F细胞(抗体表达) 293T/ACE2细胞(假病毒中和实验)
供者样本来源:Omicron感染康复者(供者3、7)和健康对照(供者4、5),症状发作后约50天采集血液 细胞分选:CD19+IgM-IgD-7-AAD-门控的记忆B细胞,基于BA.4/5 RBD抗原结合 Beacon筛选:41246个单B细胞中鉴定出137个RBD反应性细胞,其中4个具hACE2阻断活性 假病毒中和:对BA.4/5、XBB.1.5、XBB.1.16、EG.5.1的IC50值范围,2173-A6为0.134-0.29 μg/ml,3462-A4为0.117-0.22 μg/ml 竞争ELISA:2173-A6和3462-A4识别相同或重叠表位
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估康复者血清对Omicron BA.4/5 S蛋白和RBD的结合及阻断hACE2结合的能力,以筛选有中和活性的供者。
采集5名Omicron感染康复者和2名健康对照的血液,分离PBMC;ELISA检测血清与BA.4/5 S蛋白、RBD的结合,并检测血清对RBD-hACE2结合的抑制。
从候选供者的PBMC中富集并分选识别RBD的类别转换记忆B细胞,为后续单细胞筛选做准备。
使用免疫磁珠负选法分离B细胞,经抗体染色和流式分选获得CD19+IgD-IgM-RBD+细胞,并在扩增培养基中活化培养8天。
在Beacon平台上高通量筛选分泌RBD结合抗体和阻断RBD-hACE2相互作用的单B细胞。
将活化B细胞加载到OptoSelect 11k芯片,通过OEP技术将单个细胞置于NanoPens;进行两个连续实验:RBD结合检测和hACE2阻断检测;鉴定阳性细胞并从芯片导出。
从导出细胞中扩增并测序抗体VH和VL基因,用于重组抗体表达。
使用Opto Plasma B Discovery cDNA Synthesis Kit进行逆转录和cDNA扩增,Sanger测序,Geneious Biologics分析抗体序列。
在HEK293F细胞中表达纯化重组单克隆抗体,用于后续功能实验。
将重链和轻链基因克隆到pcDNA3.4载体,共转染HEK293F细胞,培养5天后收集上清,Protein A柱纯化,SDS-PAGE验证。
检测抗体对各Omicron亚型RBD的结合活性和亲和力。
ELISA检测抗体与BA.4/5、XBB.1.5、XBB.1.16、EG.5.1 RBD的结合;SPR测定亲和动力学。
评估抗体对多种SARS-CoV-2假病毒的中和能力。
将抗体与假病毒共孵育,加入293T/ACE2细胞,16小时后检测荧光素酶活性,计算IC50。
确定两株抗体的表位是否相同或重叠。
竞争ELISA:将RBD与一株抗体预孵育后,检测其与另一株抗体的结合变化;同时比较非中和抗体2479作为对照。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | OPM-293 CD05培养基 | Opmbiosciences | 81075-001 |
| KOP293表达培养基 | Kairuibiotech | K03252 | |
| KPM无血清培养基 | Kairuibiotech | K03125 | |
| 样本处理 | Ficoll分离液 | Cytiva | 10308255 |
| 样本保存 | 无血清冻存液 | Pricella | PB180438 |
| B细胞富集 | EasySep人B细胞富集试剂盒 | STEMCELL | 17954 |
| B细胞培养 | ImmunoCult人B细胞扩增试剂盒 | STEMCELL | 1000645 |
| 流式染色 | 抗CD19-APC抗体 | BioLegend | 302212 |
| 抗IgD-FITC抗体 | BioLegend | 348206 | |
| 抗IgM-FITC抗体 | BioLegend | 314506 | |
| 7-AAD染色液 | Invitrogen | 00699342 | |
| PE标记链霉亲和素偶联物 | BioLegend | 127807 | |
| 流式分选 | BD FACSAira Fusion流式细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
| Beacon筛选 | OptoSelect 11k芯片 | Berkeley Lights | -- |
| 链霉亲和素包被的检测珠 | Berkeley Lights | 520-00053 | |
| AF568标记抗人IgG二抗 | Thermo Fisher | A-21090 | |
| AF647标记hACE2 | Thermo Fisher | A330009 | |
| 裂解缓冲液 | Qiagen | 1070498 | |
| 单细胞序列分析 | Opto Plasma B Discovery cDNA合成试剂盒 | Berkeley Lights | 750-02030 |
| Agencourt RNAClean XP磁珠 | Beckman Coulter | A63987 | |
| Agencourt AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | A63881 | |
| Opto Plasma B Discovery Sanger测序准备试剂盒 | Berkeley Lights | 750-02041 | |
| 抗体表达 | pcDNA3.4 TOPO载体 | Thermo Fisher | A14697 |
| TA293转染试剂 | Kairuibiotech | K20001 | |
| 抗体纯化 | Protein A亲和层析柱 | Smart Lifesciences | SA012100 |
| ÄKTA pure 150蛋白质纯化系统 | Cytiva | -- | |
| 30kDa截留分子量超滤离心管 | Millipore | UFC903024 | |
| ELISA | 酶标板 | LABSELECT | 31111 |
| HRP标记山羊抗人IgG (H+L)抗体 | ABclonal | AS003 | |
| TMB底物 | Beyotime | P0209 | |
| HRP标记链霉亲和素 | Beyotime | A0303 | |
| 生物素化 | EZ-Link NHS-PEG4-生物素试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | A39259 |
| 亲和力测定 | Octet RH96系统 | Sartorius | -- |
| Protein A生物传感器 (Octet AHC2) | Sartorius | 18-5142 | |
| 假病毒中和实验 | 96孔板 | Corning | 3599 |
| 荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Vazyme | DD1201 | |
| 重组蛋白 | ACE2蛋白 | Sino Biological | 10108-H08H |
| Spike (BA.4/5) S1+S2三聚体蛋白 | Sino Biological | 40589-V08H32 | |
| Spike RBD BA.4/5蛋白 | Sino Biological | 40592-V08H130 | |
| Spike RBD XBB.1.5蛋白 | Sino Biological | 40592-V08H146 | |
| Spike RBD XBB.1.16蛋白 | Sino Biological | 40592-V08H136 | |
| Spike RBD EG.5.1蛋白 | Sino Biological | 40592-V08H151 | |
| 假病毒 | 假病毒(野生型和变异株) | Vazyme | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集 | 供者来源、康复期时间、采集设备 阅读提示:Materials and Methods - Human sample collection |
| B细胞分选 | B细胞分离方法、抗体panel、分选门控、培养时间 阅读提示:Materials and Methods - RBD-specific memory B cells enrichment and plasmablast activation |
| Beacon筛选 | 芯片型号、细胞数量、检测珠制备、荧光标记抗体浓度、筛选标准 阅读提示:Materials and Methods - Single RBD-specific ASCs selection by Berkeley lights Beacon system; Figure 2 |
| 抗体表达与纯化 | 表达载体、转染细胞系、转染试剂、纯化方法、缓冲液pH 阅读提示:Materials and Methods - MAbs expression and purification |
| 结合与亲和力 | ELISA包被抗原、抗体浓度、SPR传感器、分析软件 阅读提示:Materials and Methods - Binding affinity measurement; Figure 3 |
| 中和实验 | 细胞系、细胞密度、假病毒来源、孵育时间、检测试剂 阅读提示:Materials and Methods - Pseudoviruses neutralization assay; Figure 4 |