分子对接与动力学模拟预测结合
预测calceolarioside B与Omicron BA.2刺突蛋白的结合位点和相互作用
使用Schrödinger Glide进行分子对接，筛选RBD区域的结合位点，并使用GROMACS进行分子动力学模拟，计算RMSD和相互作用能。
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Calceolarioside B抑制SARS-CoV-2 Omicron BA.2变异株细胞进入并调节免疫反应
Calceolarioside B inhibits SARS-CoV-2 Omicron BA.2 variant cell entry and modulates immune response.
实验完整度
高包含分子对接、分子动力学模拟、BLI、免疫荧光、假病毒中和、MTT、ELISA和流式细胞术等多层级实验，并进行了功能验证（抑制病毒进入）和机制验证（阻断S蛋白与ACE2结合及免疫调节）。
主要模型
ACE2-EGFP/ACE2-mcherry稳转293T细胞 RLE-6TN大鼠II型肺泡上皮细胞 PBMC来源的巨噬细胞分化模型
重点核对
calceolarioside B浓度范围：免疫荧光和假病毒中和实验中为25-200 μM BLI实验中Spike-RBD蛋白固定浓度：40 μg/mL 假病毒中和实验中polybrene浓度：5 μg/mL MTT实验中calceolarioside B浓度范围：0-3200 μM，处理时间：24小时 ELISA和流式细胞术中calceolarioside B浓度：200 μM
摘要
本研究评估了从传统中药木通（Akebia quinata Thumb）中提取的calceolarioside B对SARS-CoV-2 Omicron BA.2变异株的抑制作用。分子对接和分子动力学模拟预测了calceolarioside B与Omicron BA.2刺突（S）蛋白之间的结合位点和相互作用。生物层干涉法（BLI）和免疫荧光实验验证了其高亲和力结合。假病毒进入实验评估了calceolarioside B对病毒进入宿主细胞的抑制作用，而酶联免疫吸附试验（ELISA）测量了炎症细胞因子水平。流式细胞术用于分析其对巨噬细胞表型转换的影响。结果表明，calceolarioside B能高亲和力结合Omicron BA.2 S蛋白，并通过干扰血管紧张素转换酶2（ACE2）受体与S蛋白的结合，显著抑制病毒进入宿主细胞。此外，calceolarioside B降低了IL（白细胞介素）-6表达水平，并促进巨噬细胞从促炎M1表型向抗炎M2表型转换。这些发现表明，calceolarioside B具有抗病毒和免疫调节作用，使其成为治疗COVID-19的潜在双功能抑制剂。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- calceolarioside B是否抑制SARS-CoV-2 Omicron BA.2变异株进入宿主细胞并调节免疫反应？
- 核心机制
- calceolarioside B通过高亲和力结合Omicron BA.2刺突蛋白，干扰其与ACE2受体的结合，从而抑制病毒进入；同时降低IL-6水平并促进巨噬细胞从M1向M2表型转换，发挥免疫调节作用。
- 主要证据
- 分子对接和分子动力学模拟预测结合，BLI实验显示KD为11 μM；免疫荧光和假病毒中和实验显示浓度依赖性抑制病毒进入，100 μM时抑制率约80%，200 μM时约90%；ELISA显示降低IL-6水平；流式细胞术显示M1比例降低、M2比例升高。
- 研究意义
- calceolarioside B具有抗病毒和免疫调节双重功能，为开发新的COVID-19治疗策略提供了科学依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
BLI实验验证结合亲和力
验证calceolarioside B与Omicron BA.2 Spike-RBD蛋白的结合亲和力
将Spike-RBD蛋白固定在Ni-NTA生物传感器上，与不同浓度的calceolarioside B结合，测定KD值。
免疫荧光检测S蛋白与ACE2结合的阻断
验证calceolarioside B阻断S蛋白与ACE2受体结合的能力
将Spike-RBD蛋白与calceolarioside B预孵育后加入ACE2-EGFP 293T细胞，通过荧光标记和共聚焦显微镜观察结合情况。
假病毒中和实验
评估calceolarioside B抑制Omicron BA.2假病毒进入宿主细胞的能力
将假病毒与calceolarioside B预孵育后加入ACE2-mcherry 293T细胞，通过荧光成像计数感染细胞，计算抑制率。
MTT实验测定CC50和EC50
评估calceolarioside B的细胞毒性并确定其半数有效浓度
用不同浓度calceolarioside B处理RLE-6TN细胞，测定细胞活力；将不同浓度药液与假病毒混合感染细胞，计算抑制率。
炎症因子检测和巨噬细胞极化分析
评估calceolarioside B对炎症反应和巨噬细胞极化的调节作用
用LPS或假病毒刺激RLE-6TN细胞，并加入calceolarioside B，ELISA检测IL-6水平；利用transwell共培养PBMC和RLE-6TN，流式细胞术分析M1/M2巨噬细胞比例。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 分子对接 | Schrödinger Maestro | Schrödinger | version |
| 分子动力学模拟 | GROMACS | -- | version |
| BLI实验 | Ni-NTA生物传感器 | Sartorius | 18-5114 |
| 数据分析软件9.0 | Sartorius | -- | |
| 免疫荧光 | Spike-RBD蛋白（His标签） | Sino Biological | 40592-V08H123 |
| 牛血清白蛋白 | Macklin | A801320-100 | |
| His标签抗体 | Cell Signaling Technology | 12698S | |
| Alexa Fluor® 555 鬼笔环肽二抗 | Cell Signaling Technology | 8953S | |
| FluorSave™封片剂 | Calbiochem | 345789 | |
| 假病毒中和实验 | 聚凝胺 | Vectorbuilder | -- |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| MTT实验 | MTT试剂盒 | -- | -- |
| ELISA | 大鼠IL-6 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-R0015c |
| 流式细胞术 | CD11b PE-Cy7抗体 | Tonbo Biosciences | 60-0112 |
| CD163抗体 | BioLegend | 326510 | |
| CD206抗体 | BioLegend | 321104 | |
| CD68抗体 | BioLegend | 333808 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 分子对接与动力学模拟 | 蛋白结构7UB5、配体calceolarioside B来源、受体网格位置、模拟时间1 ns、力场和温度压力参数 阅读提示：Materials and methods 中 'Preparation of the target protein and ligand'、'Molecular docking'、'Molecular dynamics simulation' |
| BLI结合实验 | Spike-RBD蛋白固定浓度40 μg/mL、calceolarioside B浓度梯度3.13-100 μM、传感器类型Ni-NTA、结合和解离时间 阅读提示：Materials and methods 中 'Biolayer interferometry (BLI) assay' |
| 免疫荧光检测 | ACE2-EGFP 293T细胞、Spike-RBD浓度、calceolarioside B浓度25-200 μM、预孵育和时间、抗体和荧光标记 阅读提示：Materials and methods 中 'Immunofluorescence of Omicron BA.2 protein binding to ACE2 293 T cells' 和 Figure 3 |
| 假病毒中和实验 | ACE2-mcherry 293T细胞、假病毒类型、polybrene浓度5 μg/mL、calceolarioside B浓度、孵育时间、感染检测 阅读提示：Materials and methods 中 'Omicron BA.2 pseudovirus based virus neutralization assay' 和 Figure 4 |
| MTT实验 | RLE-6TN细胞、CC50浓度范围0-3200 μM、EC50浓度范围0-400 μM、处理时间24小时、细胞密度 阅读提示：Materials and methods 中 'MTT assay' 和 Figure 5 |
| ELISA和流式细胞术 | LPS浓度5 mg/L、calceolarioside B浓度200 μM、PBMC来源、共培养条件、抗体和仪器设置 阅读提示：Materials and methods 中 'ELISA'、'Flow cytometry' 和 Figure 6 |