抗体筛选与鉴定
从免疫的转基因小鼠中筛选能够与Omicron RBD结合并阻断ACE2结合的抗体。
使用人抗体转基因小鼠BA-huMab进行免疫，通过噬菌体展示技术构建抗体库，筛选出与BA.1 RBD结合的ScFv，并转化为IgG1抗体进行功能验证。
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识别多种SARS-CoV-2变异株RBD区域中一个高度保守的中和表位
Identification of a highly conserved neutralizing epitope within the RBD region of diverse SARS-CoV-2 variants.
实验完整度
高包含体外假病毒中和实验、真病毒中和实验、SPR亲和力测定、ADCC/ADCP功能分析、冷冻电镜结构解析、小鼠模型保护和逃逸突变筛选等多个独立证据层级，并进行功能与机制验证。
主要模型
Vero E6细胞 Huh-7细胞 K18-hACE2转基因小鼠 BALB/c小鼠
重点核对
中和抗体的剂量（如2或10 mg/kg）及给药途径（腹腔注射、滴鼻、气溶胶吸入） 感染剂量（1×10^5 FFU）和感染时间点（感染前24小时或感染后8小时） 病毒株（Omicron BA.5和XBB.1）及检测时间点（感染后2或4天） 抗体组合（BA7535/BA7208）的协同效应 血清抗体浓度测定时间点（5分钟至336小时）
摘要
SARS-CoV-2变异株的不断出现持续损害现有中和抗体的效力，尤其是XBB.1.5和EG.5，它们表现出卓越的免疫逃逸特性。在这里，我们识别了一个被广谱中和抗体BA7535靶向的高度保守的中和表位，该抗体不仅对先前的变异株（如Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron BA.1-BA.5）具有高中和效力，而且对最近出现的Omicron亚变异株（包括BF.7、CH.1.1、XBB.1、XBB.1.5、XBB.1.9.1、EG.5）也有效。使用冷冻电镜对Omicron Spike三聚体与BA7535-Fab复合物的结构分析表明，BA7535识别一个高度保守的隐蔽受体结合域（RBD）表位，避开了RBD中大多数突变热点。此外，基于BA7535-Fab/RBD复合物相互作用的构象模拟解析了BA7535对最新变异株的广谱中和效应。单独使用BA7535或与BA7208联用的治疗性和预防性处理保护雌性小鼠免受流行的Omicron BA.5和XBB.1变异株感染，表明高度保守的中和表位可作为开发高效治疗性抗体和疫苗的潜在靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在识别一个高度保守的RBD表位，以开发能够广谱中和多种SARS-CoV-2变异株的抗体，从而应对持续出现的免疫逃逸。
- 核心机制
- BA7535通过结合RBD顶部区域的保守表位，直接阻断RBD与ACE2受体的结合，从而抑制病毒入侵宿主细胞。
- 主要证据
- 基于冷冻电镜结构分析，BA7535-Fab与Omicron BA.2 Spike三聚体复合物的结构显示其表位位于RBD顶部，避开大多数突变热点；同时，体外中和实验显示BA7535对超过30种变异株具有高效中和活性（IC50范围0.38-274.4 ng/mL）。
- 研究意义
- 本研究揭示的保守表位可作为开发广谱中和抗体和疫苗的潜在靶点，为应对未来SARS-CoV-2变异株提供策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外中和活性评估
评估BA7535单用或与BA7208联用对多种变异株的中和效力。
利用VSV假病毒系统和真病毒中和实验（FRNT），检测抗体对超过30种变异株的中和IC50值。
结构解析
通过冷冻电镜解析BA7535-Fab与Omicron Spike三聚体的复合物结构，阐明其广谱中和机制。
制备Omicron BA.2 Spike蛋白与BA7535-Fab复合物，进行冷冻电镜数据采集和结构解析，获得整体分辨率2.4Å，局部分辨率3.07Å的结构。
效应功能分析
评估BA7535和BA7208的ADCC和ADCP活性。
使用报告基因生物assay检测抗体介导的ADCC和ADCP活性，通过荧光素酶信号反映Fc受体信号通路激活。
体内保护实验
评估BA7535单用或与BA7208联用对小鼠感染Omicron变异株的保护效果。
在K18-hACE2转基因小鼠中，采用腹腔注射BA7535（2或10 mg/kg）于感染前24小时或感染后8小时，之后用Omicron BA.5攻击；在BALB/c小鼠中，采用腹腔（10 mg/kg）、滴鼻（1 mg/kg）或气溶胶吸入（3 mg/kg）给予BA7535，用XBB.1攻击，检测肺部和脑组织病毒载量及病理变化。
逃逸突变筛选
评估BA7535单用或与BA7208联用时产生逃逸突变的风险。
在Vero E6细胞中连续传代SARS-CoV-2 BA.5，在抗体压力下监测病毒突变，通过下一代测序分析spike基因突变。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 抗体筛选与鉴定 | 免疫剂量（35 μg/鼠）、免疫周期（10天间隔）、筛选方法（ELISA） 阅读提示：Methods: Immunization, Phage display library construction and screening |
| 体外中和活性评估 | 假病毒/真病毒系统、细胞系（Huh-7、Vero E6）、病毒株、IC50计算 阅读提示：Methods: Pseudovirus neutralization assay, Focus reduction neutralization test (FRNT) |
| 结构解析 | 蛋白浓度、摩尔比、冷冻电镜参数（如像素大小、剂量） 阅读提示：Methods: Cryo-EM sample preparation and data acquisition, Image processing |
| 效应功能分析 | 靶细胞、效应细胞、抗体浓度、孵育时间 阅读提示：Methods: ADCC, ADCP |
| 体内保护实验 | 小鼠品系、年龄、性别、剂量、给药途径、感染剂量、检测时间点 阅读提示：Methods: Protection against Omicron BA.5 in K18-hACE2-transgenic mice, Protection against Omicron XBB.1 in BALB/c mice |
| 逃逸突变筛选 | 细胞系、MOI、抗体浓度梯度、传代次数 阅读提示：Methods: Escape mutant screening and high-throughput sequencing |