体外验证hACE2和hTMPRSS2共表达增强病毒感染
验证在体外细胞中同时表达hACE2和hTMPRSS2是否能增强SARS-CoV-2的进入和复制
将hACE2和hTMPRSS2共转染A549细胞，通过Western blot检测表达；使用假病毒和活病毒评估病毒感染性；RT-qPCR检测病毒RNA水平。
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表达人ACE2和TMPRSS2的致死性小鼠模型的建立用于SARS-CoV-2感染和发病机制研究
Generation of a lethal mouse model expressing human ACE2 and TMPRSS2 for SARS-CoV-2 infection and pathogenesis.
实验完整度
高包含体外细胞转染、体内瞬时转染、双转基因小鼠感染、病毒变异株比较、病理和免疫分析以及抑制剂治疗等多个独立证据层级，并明确进行了功能与机制验证。
主要模型
A549细胞（人肺泡上皮细胞系） C57BL/6小鼠（体内瞬时转染） hACE2和hTMPRSS2双转基因小鼠
重点核对
双转基因小鼠中hACE2和hTMPRSS2的组织表达模式 SARS-CoV-2感染剂量（2×10^3 PFU，即10 MLD50）和途径（鼻内接种） TMPRSS2抑制剂naphostat的给药剂量（3 mg/kg）和时间（感染前2小时） SARS-CoV-2变异株（Beta和Omicron）的感染结果比较 病毒滴度测定（肺组织空斑实验）和病毒载量检测（RT-qPCR）
摘要
表达人ACE2的小鼠模型已被频繁用于理解2019冠状病毒病的发病机制和开发针对SARS-CoV-2的治疗策略。鉴于人TMPRSS2支持病毒进入、复制和发病机制，我们建立了同时表达人ACE2和TMPRSS2的双转基因小鼠模型用于SARS-CoV-2感染。两个基因的共过表达在体外和体内均增加了病毒感染性。双转基因小鼠在病毒感染后表现出显著的体重下降、临床症状、急性肺损伤、肺部炎症和致死性，表明它们对SARS-CoV-2高度易感。用TMPRSS2抑制剂甲磺酸萘莫司他预处理可有效减少双转基因小鼠中病毒诱导的体重下降、病毒复制和死亡率。此外，在该动物模型中证实了SARS-CoV-2变异株的易感性和差异性发病机制。总之，我们的结果表明，双转基因小鼠可提供一个高度易感的病毒感染小鼠模型，以理解SARS-CoV-2发病机制并评估针对2019冠状病毒病的抗病毒治疗。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探究同时表达人ACE2和人TMPRSS2的双转基因小鼠是否对SARS-CoV-2感染高度易感，并可用于评价抗病毒治疗。
- 核心机制
- 人ACE2作为病毒受体，人TMPRSS2介导刺突蛋白的蛋白水解裂解，两者共同促进病毒进入和感染；TMPRSS2抑制剂可通过阻断该过程降低感染。
- 主要证据
- 双转基因小鼠感染SARS-CoV-2后出现体重下降、临床症状、肺损伤和死亡，且TMPRSS2抑制剂预处理可减轻体重下降、降低病毒载量和死亡率；同时Beta和Omicron变异株显示出不同致病性。
- 研究意义
- 该双转基因小鼠模型高度易感SARS-CoV-2，可用于理解病毒发病机制和评估抗病毒疗法（包括药物和疫苗）。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内瞬时转染验证共表达增强病毒感染
验证在活体小鼠中瞬时共表达hACE2和hTMPRSS2是否能增强SARS-CoV-2感染
通过鼻内转染将质粒导入C57BL/6小鼠，感染SARS-CoV-2后检测肺部病毒RNA水平。
建立双转基因小鼠和感染模型
建立稳定表达hACE2和hTMPRSS2的双转基因小鼠，并确定SARS-CoV-2感染剂量和病毒分布
通过微注射产生双转基因小鼠，通过RT-qPCR检测组织表达；感染不同剂量病毒确定MLD50；感染10 MLD50 (2×10^3 PFU)后检测体重、存活、症状、病毒滴度和组织分布。
评估肺部炎症和病理变化
评估SARS-CoV-2感染后双转基因小鼠的炎症反应和肺损伤
收集感染后0、3、6天肺组织，进行多重细胞因子/趋化因子分析和组织病理学检查。
测试TMPRSS2抑制剂的效果
验证TMPRSS2抑制剂naspamostat是否能减轻SARS-CoV-2感染引起的症状和死亡
感染前2小时鼻内给予3 mg/kg nafamostat，监测体重、存活、症状；测量病毒滴度和载量；进行肺组织病理分析。
比较SARS-CoV-2变异株的感染性
评估双转基因小鼠能否反映SARS-CoV-2不同变异株的致病性差异
分别感染Wuhan株、Beta变异株和Omicron变异株，比较体重、存活、症状、病毒滴度和载量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Cytiva | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | -- | |
| 动物实验 | 异氟烷 | -- | -- |
| 磷酸盐缓冲液 | -- | -- | |
| 组织匀浆 | tacoPrep珠磨匀浆器 | GeneReach Biotechnology Corp. | -- |
| 假病毒生产 | NR-52948 (假病毒生产质粒试剂盒) | BEI Resources | -- |
| 病毒扩增 | Vero细胞 | ATCC | CCL-81 |
| TMPRSS2抑制剂处理 | 甲磺酸萘莫司他 | Sigma-Aldrich | N0289 |
| 0.9%生理盐水 | Daihan Pharm. Co., Ltd. | -- | |
| 质粒转染 | pCMV3-hACE2-FLAG质粒 | Sino Biological | HG10108-CF |
| pCMV3-hTMPRSS2-HA质粒 | Sino Biological | HG13070-CY | |
| 体外转染 | TransIT-LT1转染试剂 | Mirus Bio | -- |
| 体内转染 | in vivo-jetPEI试剂 | Polyplus | -- |
| 空斑实验 | 羧甲基纤维素 | -- | -- |
| 结晶紫 | -- | -- | |
| ImmunoSpot分析仪 | Cellular Technology Ltd. | -- | |
| RNA提取 | RNeasy Mini试剂盒 | QIAGEN | -- |
| Maxwell RSC simplyRNA组织试剂盒 | Promega | -- | |
| RT-qPCR | QuantStudio 3实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- |
| PrimeScript III RT-qPCR预混液 | Takara | -- | |
| 2019-nCoV RUO试剂盒 | Integrated DNA Technologies | 10006713 | |
| Western blot | PVDF膜 | Merck Millipore | -- |
| 脱脂牛奶 | BD Biosciences | -- | |
| 抗hACE2抗体 | Abcam | -- | |
| 抗FLAG M2抗体 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 抗HA标签抗体 (6E2) | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗GAPDH抗体 (14C10) | Cell Signaling Technology | -- | |
| 辣根过氧化物酶标记的二抗 | Bio-Rad | -- | |
| 增强化学发光试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 多重免疫分析 | MILLIPLEX人细胞因子/趋化因子磁珠检测板 | Merck Millipore | HCYTOMAG-60K |
| Luminex 200多重检测仪 | Merck Millipore | 40-012 | |
| 组织病理学 | 10%中性缓冲福尔马林 | -- | -- |
| 石蜡 | Leica | -- | |
| 自动染色仪 | Leica | -- | |
| 免疫组织化学 | 抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白兔单克隆抗体 | Sino Biological | 40143-R001 |
| 显微镜 | Olympus BX51显微镜 | Olympus | -- |
| 图像分析 | Nuance 3.02软件 | PerkinElmer | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 双转基因小鼠的生成和验证 | hACE2和hTMPRSS2的组织表达模式 阅读提示：参见“Materials and methods”中的“Mice”和Fig. 2 |
| SARS-CoV-2感染模型 | 感染剂量、途径、小鼠周龄和性别 阅读提示：参见“Materials and methods”中的“Mice”和Fig. 3 |
| TMPRSS2抑制剂处理 | naphostat剂量、给药时间和途径 阅读提示：参见“Materials and methods”中的“TMPRSS2 inhibitor treatment”和Fig. 6 |
| 病毒变异株感染比较 | 变异株种类、感染剂量和检测时间点 阅读提示：参见“Results”中的“Comparison of SARS-CoV-2 variant infection”和Fig. 7 |