病例纳入与样本采集
收集SARS-CoV-2感染尸体的鼻咽拭子样本，用于分析病毒载量和滴度随时间的变化。
从2021年8月至10月，在神奈川齿科大学法医中心接收的尸体中，筛选SARS-CoV-2抗原阳性且生前RT-qPCR阳性的尸体，获得6例同意后，采集鼻咽拭子样本，在死后至尸检前多次（3至7次）采集，样本立即放入培养基并-80°C冷冻保存。
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SARS-CoV-2感染尸体中SARS-CoV-2病毒载量和滴度随时间的变化
Changes in SARS-CoV-2 viral load and titers over time in SARS-CoV-2-infected human corpses.
实验完整度
中研究包含病例系列、RT-qPCR检测、病毒分离培养、组织病理学及免疫组化，但为观察性研究，无干预或功能验证。
主要模型
人类尸体鼻咽拭子样本 VeroE6/TMPRSS2细胞
重点核对
病例纳入标准：SARS-CoV-2抗原检测阳性且RT-qPCR阳性 尸体在4°C冷藏条件下储存 鼻咽拭子样本采集时间点为死后多次（3至7次） 病毒分离方法：VeroE6/TMPRSS2细胞接种，观察细胞病变效应，RT-qPCR确认病毒增殖 TCID50测定用于病毒滴度
摘要
在人类尸体中，在死后很长时间后检测到了具有传染性的严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的高病毒滴度。然而，关于传染性SARS-CoV-2在尸体中的动力学知之甚少。在这项病例系列研究中，我们通过收集六名SARS-CoV-2感染患者死后多个时间点的鼻咽拭子样本，调查了人类尸体中传染性SARS-CoV-2的死后动力学。通过定量逆转录-聚合酶链反应从所有六名死者收集的鼻咽拭子样本中检测到SARS-CoV-2 RNA。病毒培养显示，在一名死者中，死后12天内存在传染性病毒。值得注意的是，该患者从症状出现到死亡的时间比其他患者短，尸检样本显示与上呼吸道病毒复制一致的病理发现。因此，该患者在病毒脱落期死亡，并且尸体中传染性病毒的量直到尸检日期（死后12天）都没有随时间减少。这项研究的结果表明，SARS-CoV-2在尸体中的持续存在可能因人而异，并且可能与死亡时的疾病阶段有关。这些重要的结果补充了许多先前报道的关于SARS-CoV-2死后传染性的发现。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人类尸体中传染性SARS-CoV-2的滴度随时间如何变化？
- 核心机制
- 死者死亡时处于病毒脱落期（症状出现至死亡时间短），上呼吸道存在活跃病毒复制，导致死后传染性病毒持续存在。
- 主要证据
- 6例尸体鼻咽拭子RT-qPCR均检出病毒RNA，但仅1例（Case 1）通过病毒培养在死后6、11、12天分离出传染性病毒，滴度约300、3000、300 TCID50/mL；尸检病理显示该例上呼吸道有病毒复制证据。
- 研究意义
- 研究结果表明SARS-CoV-2在尸体中的持续存在可能因人而异，并与死亡时的疾病阶段相关，对尸体处理人员的感染风险有潜在影响。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
病毒RNA检测与定量
检测鼻咽拭子样本中SARS-CoV-2 RNA并定量病毒拷贝数。
使用MagMAX Viral/Pathogen Nucleic Acid Isolation Kit或Maxwell RSC Viral Total Nucleic Acid Kit提取核酸，通过RT-qPCR检测并定量SARS-CoV-2 RNA，标准曲线由阳性对照（10^1至10^6拷贝/反应）建立。
病毒分离与滴度测定
评估鼻咽拭子样本中是否存在传染性病毒并测定滴度。
所有RT-qPCR阳性样本使用VeroE6/TMPRSS2细胞进行病毒分离，观察细胞病变效应，5天后收集上清，用SARS-CoV-2 direct detection RT-qPCR kit确认病毒增殖，并对阳性样本测定TCID50。
全基因组测序与分型
确定病毒基因组序列和谱系，并比较分离病毒与原始样本的一致性。
对足够病毒载量（Ct值<32）的样本进行下一代全基因组测序，遵循nCoV-2019测序协议，使用QIAseq FX DNA Library Kit构建文库，在MiSeq系统上测序，并使用Pangolin COVID-19 Lineage Assigner v.4.3.1确定谱系。
组织病理学与免疫组化检查
评估肺部病理变化及SARS-CoV-2抗原在上呼吸道的分布。
对所有病例的尸检组织样本进行石蜡包埋，苏木精-伊红染色和免疫组化染色（使用兔单克隆抗体检测SARS-CoV-2核衣壳蛋白）。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 样本采集与保存 | Sugiyama-Gen有限公司 | -- | -- |
| 核酸提取 | MagMAX病毒/病原体核酸提取试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Maxwell RSC病毒总核酸提取试剂盒 | Promega | -- | |
| 病毒分离 | VeroE6/TMPRSS2细胞 | Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank | JCRB1819 |
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 抗生素-抗真菌溶液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 病毒增殖确认 | SARS-CoV-2直接检测RT-qPCR试剂盒 | Takara | -- |
| 全基因组测序文库构建 | QIAseq FX DNA文库构建试剂盒 | Qiagen | -- |
| 全基因组测序 | MiSeq系统 | Illumina | -- |
| 组织学检查 | 兔单克隆抗体抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白 | Sino Biological | 40143-R001 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本采集 | 病例筛选标准：SARS-CoV-2抗原阳性且生前RT-qPCR阳性；尸体冷藏温度；鼻咽拭子采集时间点；样本保存条件 阅读提示：Methods: Cases and sample collection; Table 1 |
| 病毒RNA检测 | 核酸提取试剂盒；RT-qPCR引物探针；标准曲线范围；Ct值转换方法 阅读提示：Methods: RT-qPCR |
| 病毒分离 | 细胞系（VeroE6/TMPRSS2）；细胞培养条件（培养基、血清浓度、抗生素）；接种量；观察时间；TCID50测定方法 阅读提示：Methods: Cell culture and viral isolation |
| 全基因组测序 | 样本选择标准（Ct值<32）；测序协议版本；文库构建试剂盒；测序平台 阅读提示：Methods: Whole-genome sequencing for SARS-CoV-2 |
| 组织病理学 | 组织取材部位；石蜡包埋流程；HE染色；免疫组化抗体及稀释度 阅读提示：Methods: Histological examination; Figure 2B |