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        ATG14靶向脂滴并作为Syntaxin18调节的脂滴周转的自噬受体

        ATG14 targets lipid droplets and acts as an autophagic receptor for syntaxin18-regulated lipid droplet turnover.

        作者信息Zhen Yuan, Kun Cai, Jiajia Li, Ruifeng Chen, Fuhai Zhang, Xuan Tan, Yaming Jiu, Haishuang Chang, Bing Hu, Weiyi Zhang, Binbin Ding
        PMID38245527
        期刊Nat Commun
        发布时间2024-01
        DOI10.1038/s41467-024-44978-w
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        包含细胞实验、体外生化实验、敲除/敲低、免疫电镜、透射电镜、SARS-CoV-2感染等多个独立实验层级，并进行功能与机制验证。

        主要模型

        HeLa细胞 HEK293T细胞 Vero-E6细胞 MEF细胞

        重点核对

        ATG14的BATS域（W484R/F485R/Y488R突变）对LD定位至关重要 ATG14的LIR基序（WL/AA突变）介导与ATG8s互作和脂噬受体功能 STX18残基71-80介导与ATG14结合并抑制PI3KC3-C1复合物形成 SARS-CoV-2 M蛋白与STX18互作（M蛋白20-100aa） Viperin的LD定位（N端α螺旋）对其降解至关重要

        摘要

        脂滴（LDs）是动态的脂质储存细胞器，可通过自噬机制降解以释放中性脂质，这一过程称为脂噬。然而，脂噬的特异性受体和调控机制仍大多未知。在此，我们确定ATG14是PI3KC3-C1复合物的核心亚基，也靶向LD并作为促进LD降解的自噬受体。一个负调控因子Syntaxin18（STX18）与ATG14结合，破坏ATG14-ATG8家族成员相互作用并削弱PI3KC3-C1复合物的形成。敲低STX18激活依赖于ATG14的脂噬，ATG14不仅作为PI3KC3-C1复合物的核心亚基，还作为自噬受体，导致LD相关的抗病毒蛋白Viperin降解。此外，冠状病毒M蛋白与STX18结合，破坏STX18-ATG14相互作用以诱导脂噬并降解Viperin，从而促进病毒产生。总之，我们的数据为ATG14在脂质代谢和病毒产生中的额外作用提供了一种先前未描述的机制。 脂噬是自噬机制对脂滴的降解。在这里，作者发现自噬蛋白ATG14也靶向脂滴，并与ATG8蛋白相互作用，作为STX18调控的脂噬的自噬受体。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        脂噬的特异性受体及其调控机制尚不清楚，ATG14是否作为脂噬受体调控脂滴周转，以及STX18和冠状病毒如何影响该过程？
        核心机制
        ATG14靶向脂滴并通过LIR基序与ATG8s互作，作为自噬受体介导脂噬；STX18通过其71-80残基与ATG14的CCD结合，破坏ATG14-ATG8s互作和PI3KC3-C1复合物形成，抑制脂噬；SARS-CoV-2 M蛋白与STX18结合，阻断STX18-ATG14互作，激活ATG14介导的脂噬，降解脂滴相关抗病毒蛋白Viperin，促进病毒复制。
        主要证据
        免疫荧光共定位、LD纯化、免疫电镜、GST pull-down、共免疫沉淀、CRISPR敲除/敲低、脂滴荧光定量、甘油三酯测定、透射电镜和SARS-CoV-2感染实验等多种方法。
        研究意义
        揭示了ATG14在脂质代谢和病毒产生中的新作用，提示靶向STX18-ATG14轴可能为阻断病毒复制提供潜在策略。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        验证ATG14靶向脂滴

        明确ATG14是否定位于脂滴及其定位条件

        在HeLa和Vero-E6细胞中通过共聚焦显微镜观察BODIPY标记的LD与mCherry-ATG14的共定位，用油酸（OA）处理12小时诱导脂滴生成；纯化脂滴蛋白进行Western blot；用免疫电镜观察GFP-ATG14在LD膜上的分布

        2

        验证ATG14介导的脂噬功能

        探究ATG14过表达或敲低对脂滴数量和甘油三酯水平的影响，以及是否通过溶酶体途径降解

        在HeLa细胞中敲低ATG14或过表达ATG14及其突变体，用OA处理，检测脂滴数量和甘油三酯浓度；用CQ或Baf-A1处理抑制溶酶体功能；在Atg14 KO细胞中回补野生型或突变体

        3

        验证ATG14作为自噬受体与ATG8s互作

        确定ATG14是否通过LIR基序与ATG8s互作，并在脂噬中作为受体招募LC3

        通过GST pull-down和免疫共沉淀检测ATG14与多种ATG8s的结合；血清饥饿诱导脂噬，观察ATG14、LC3和LD的共定位；检测LIR突变体（ATG14LIRm）对LC3招募及脂噬的影响

        4

        验证STX18对ATG14-ATG8s互作及PI3KC3-C1复合物形成的负调控

        明确STX18如何调控ATG14介导的脂噬

        通过siRNA筛选初步发现STX18敲低诱导自噬；检测STX18与ATG14的互作；过表达或敲低STX18检测ATg14-ATG8s互作变化；检测PI3KC3-C1复合物形成（免疫共沉淀、纯化蛋白凝胶过滤）；使用PI3P ELISA和PI3P传感器检测LD相关PI3P产生

        5

        验证STX18缺失诱导ATG14依赖的脂噬

        确定STX18敲低是否通过ATG14依赖的脂噬导致脂滴降解

        在STX18敲低的HeLa细胞中进行脂滴数量统计、甘油三酯测定、LC3-LD共定位、透射电镜观察脂噬；使用RFP-GFP-Plin2报告基因；在Atg14 KO或Atg5 KO等细胞中验证依赖性；通过回补STX18缺失突变体验证关键区域

        6

        验证STX18缺失诱导Viperin降解

        探究脂噬是否导致脂滴相关抗病毒蛋白Viperin的降解

        在STX18敲低或ATG14过表达细胞中用OA处理，检测Viperin蛋白水平；使用Viperin突变体（△1-42、ALDI-Viperin）验证LD定位必要性；通过回补实验和Atg7敲低、CQ处理确证依赖性

        7

        验证SARS-CoV-2感染及M蛋白诱导脂噬

        探究SARS-CoV-2是否利用STX18-ATG14轴诱导脂噬以降解Viperin并促进病毒复制

        检测SARS-CoV-2感染细胞LC3-LD共定位和脂噬超微结构；验证M蛋白与STX18互作及对STX18-ATG14互作的影响；检测M蛋白对脂滴数量、Viperin降解和病毒复制的影响；通过过表达STX18或ATG14LIRm挽救实验

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证蛋白定位
        共聚焦显微镜免疫电镜脂滴纯化蛋白质印迹
        验证蛋白互作
        共免疫沉淀GST pull-down实验
        验证细胞功能变化
        脂滴定量甘油三酯定量RFP-GFP-Plin2实验透射电子显微镜
        验证基因敲除/敲低
        CRISPR/Cas9敲除RNA干扰（siRNA）
        验证脂质信号
        PI3P ELISA实验PI3P探针
        评估病毒复制
        实时定量PCR病毒感染实验

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        细胞培养杜氏改良Eagle培养基Gibco11995065
        胎牛血清Sigma-Aldrich12303C
        青霉素-链霉素Gibco15140163
        Freestyle 293培养基Union BiotechUp-1000
        脂滴标记BODIPY-493/503ThermoFisher ScientificD3922
        LipidTOX Red中性脂质染色剂ThermoFisher ScientificH34476
        LipidTOX Deep Red中性脂质染色剂ThermoFisher ScientificH34477
        药物处理油酸Sigma-AldrichO1008
        氯喹Sigma-AldrichC6628
        巴弗洛霉素A1Selleck ChemicalsS1413
        转染线性聚乙烯亚胺Yeasen40815ES03
        Lipofectamine 2000Invitrogen11668019
        riboFECT CP转染试剂盒RiboBioC10511-05
        免疫沉淀抗Flag M2亲和凝胶Sigma-AldrichA2220
        抗HA磁珠BimakeB26202
        抗Myc磁珠BimakeB26301
        蛋白纯化Strep-Tactin树脂Smart Lifesciences--
        谷胱甘肽树脂GeneScriptL00206
        交联双琥珀酰亚胺辛二酸酯ThermoFisher Scientific21555
        免疫荧光染色DAPI染色液ServicebioG1012
        抗体小鼠抗Flag抗体ABclonalAE005
        小鼠抗HA抗体ABclonalAE008
        小鼠抗GFP抗体ABclonalAE012
        小鼠抗GST抗体ABclonalAE001
        小鼠抗His抗体ABclonalAE003
        小鼠抗mCherry抗体ABclonalAE002
        兔抗ATG14抗体ABclonalA7526
        兔抗Beclin1抗体ABclonalA7353
        小鼠抗Tubulin抗体Developmental Studies Hybridoma BankE7S
        小鼠抗p62抗体AbnovaH00008878-M01
        小鼠抗Myc抗体Cell Signaling Technology2276
        兔抗Atg7抗体Cell Signaling Technology8558
        兔抗LC3抗体MBLPM036
        兔抗GFP抗体Abcamab6556
        小鼠抗STX18抗体Santa Cruz Biotechnologysc-293067
        小鼠抗GAPDH抗体Santa Cruz Biotechnologysc-365062
        兔抗Vps34抗体Echelon BioscienceZ-R015
        兔抗ATG14抗体Proteintech19491-1-AP
        兔抗Viperin抗体Proteintech28089-1-AP
        兔抗CLIMP63抗体Proteintech16686-1-AP
        兔抗REEP5抗体Proteintech14643-1-AP
        小鼠抗SARS-CoV-2核衣壳抗体Sino Biological Inc.40143-MM05
        小鼠抗VSV-M抗体kerafastEB0011
        HRP偶联的山羊抗小鼠IgG (H+L)AbclonalAS003
        HRP偶联的山羊抗兔IgG (H+L)AbclonalAS014
        过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG轻链特异性抗体Jackson Immunoresearch115-035-174
        过氧化物酶标记的单克隆小鼠抗兔IgG轻链特异性抗体Jackson Immunoresearch211-032-171
        Alexa Fluor 488偶联的山羊抗小鼠IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA32723
        Alexa Fluor 488偶联的山羊抗兔IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA32731
        Alexa Fluor 568偶联的山羊抗小鼠IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA-11031
        Alexa Fluor 568偶联的山羊抗兔IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA-11036
        Alexa Fluor 647偶联的山羊抗小鼠IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA-21236
        Alexa Fluor 647偶联的山羊抗兔IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA-21244
        ELISAIII类PI3K ELISA试剂盒EchelonK-3000
        甘油三酯定量甘油三酯比色法检测试剂盒Cayman Chemical10010303
        RNA提取病毒DNA/RNA提取试剂盒TianlongT016
        病毒检测COVID-19核酸检测试剂盒eDiagnosis--
        成像共聚焦显微镜LSM780Zeiss--
        透射电镜透射电子显微镜H-7000FAHitachi--
        免疫电镜透射电子显微镜Talos L 120 CThermo Fisher/FEI--
        电镜切片Leica EM UC7超薄切片机Leica--

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        LD诱导
        OA浓度200μM，处理时间（6小时或12小时），细胞类型（HeLa、Vero-E6等）
        阅读提示：Methods: OA induced LD accumulation
        细胞培养
        培养基（DMEM）、血清（10% FBS）、抗生素（1%青霉素-链霉素）、培养条件（37°C, 5% CO2）
        阅读提示：Methods: Cell cultures
        转染
        转染试剂（PEI、Lipofectamine 2000、riboFECT CP）、转染时间（24或36小时）
        阅读提示：Methods: DNA transfection and RNA interference
        敲低/敲除
        siRNA序列、敲除细胞系（Atg14 KO、Stx18 KO）、敲低时间（48小时）
        阅读提示：Methods: Generation of KO cell line using CRISPR/Cas9, DNA transfection and RNA interference
        脂滴定量
        BODIPY-493/503标记、计数细胞数量（通常50个）、统计分析（双尾非配对t检验）
        阅读提示：Figure legends (Fig. 1-7) and Methods: Immunofluorescence analysis, Image analysis
        蛋白互作
        裂解缓冲液（TAP buffer）、抗体、磁珠/凝胶、洗涤次数
        阅读提示：Methods: Immunoprecipitation and western blot
        脂质定量
        甘油三酯检测试剂盒（Cayman Chemical, 10010303）、细胞处理（OA 12小时）
        阅读提示：Methods: Triglyceride quantification assay
        SARS-CoV-2感染
        病毒株（WBP）、MOI（0.05 PFU/cell）、感染时间（1小时）、培养时间（24小时）、BSL-3条件
        阅读提示：Methods: SARS-CoV-2 virus infection

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