A next-generation Fab library platform directly yielding drug-like antibodies with high affinity, diversity, and developability.
包含文库构建、噬菌体展示筛选、酵母展示筛选、IgG转化、亲和力测定及多种可开发性评估（如SEC、HIC、Tm、cGE、DLS）等多层级验证。
Fab噬菌体展示文库 scFab酵母展示文库 Expi293F细胞表达系统
噬菌体展示筛选使用hIFNα-2b和SARS-CoV-2 RBD作为靶标，浓度分别为320 nM和330 nM。 酵母展示筛选使用FACS分选，最终结合群体在5 nM抗原浓度下仍有显著结合。 IgG转化使用Expi293F细胞瞬时转染，表达水平范围0.05至超过100 μg/mL。 亲和力测定使用SPR（Carterra LSA-XT），hIFNα-2b抗体亲和力范围18 pM至74 nM，中位数为2.3 nM。
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建半合成Fab噬菌体文库，并验证其质量。
使用五个治疗性抗体支架（如abrilumab、crenezumab、necitumumab、adalimumab），将源自健康供体的天然CDR（HCDR1-2和LCDR1-3）与HCDR3（来自10个健康供体）克隆到pANDA5噬菌粒载体，电转化E. coli TG1，获得约1.6×10^10转化子。通过Sanger测序、PacBio、NovaSeq和ELISA评估功能性和展示水平。
从Fab噬菌体文库中富集特异性结合靶标的抗体。
使用靶标hIFNα-2b或SARS-CoV-2 RBD进行三轮噬菌体淘选，通过磁珠分离和洗涤提高特异性。第3轮后，通过ELISA评估多克隆和单克隆结合。
将噬菌体展示输出转换为scFab格式，并在酵母表面展示用于进一步筛选。
通过两步PCR将Fab噬菌体向量转化为scFab，并克隆到酵母展示载体，转化EBY100酵母。通过流式细胞术验证展示和结合。
通过FACS分选富集高亲和力scFab，并分析多样性。
使用FACS分选针对靶标的高亲和力结合剂。分选后，分析单克隆结合，并通过Sanger测序和PacBio测序评估多样性。
评估scFab转化为全长IgG的效率。
将scFab抗体转换为全长IgG，通过线性表达盒在Expi293F细胞中表达。5天后测量IgG浓度和结合活性。
评估IgG抗体的亲和力和可开发性。
使用SPR测量亲和力。使用HIC、SEC、Tm、Tonset、cGE、DLS等方法评估可开发性。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 文库构建 | pANDA5噬菌粒载体 | -- | -- |
| BssHII限制性内切酶 | NEB | R0131L | |
| NheI限制性内切酶 | NEB | R0199L | |
| 大肠杆菌TG1 | Lucigen | 60502-2 | |
| 噬菌体展示选择 | 生物素化人干扰素α-2b | GenScript | Z03002 |
| 生物素化SARS-CoV-2 RBD | ACRO Biosystems | SPD-C82E9 | |
| Dynabeads M-280磁珠 | ThermoFisher | 11205D | |
| XL1Blue菌株 | Agilent | -- | |
| ELISA | 抗Fab抗体 | Millipore Sigma | I5260 |
| 抗M13-辣根过氧化物酶抗体 | Sino Biological | 11973-MM05T-H | |
| scFab转换 | DpnI限制性内切酶 | New England Biolabs | R0176S |
| NEBuilder® HiFi DNA组装预混液 | New England Biolabs | E2621L | |
| Zymo Research DNA清洁浓缩试剂盒 | Zymo Research | D4004 | |
| 酵母展示 | FACSAria流式细胞分选仪 | Becton Dickinson | -- |
| IgG表达 | Expi293F细胞 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| One Shot™ OmniMAX™ 2 T1R化学感受态大肠杆菌 | Thermo Fisher | C854003 | |
| 亲和力测定 | Carterra LSA表面等离子体共振仪 | Carterra | -- |
| 抗人Fc抗体 | Southern Biotech | 2048-01 | |
| N-羟基硫代琥珀酰亚胺 | Sigma | 56485 | |
| N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐 | Sigma | E7750 | |
| 可开发性评估 | MAbPac HIC-10色谱柱 | ThermoFisher | -- |
| Superdex 200 Increase 5/150 GL色谱柱 | Cytiva | 28-9909-45 | |
| UNcle系统 | Unchained Labs | -- | |
| Labchip GX Touch系统 | PerkinElmer | -- | |
| Stunner仪器 | Unchained Labs | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 文库构建 | 支架序列：五个临床抗体（abrilumab、crenezumab、necitumumab、adalimumab及一个非治疗性支架）及其VH/VL种系基因。CDR来源：HCDR1-2和LCDR1-3来自40个供体的NGS数据；HCDR3来自10个供体的CD19+ B细胞。克隆方法：使用限制性酶BssHII和NheI。转化效率：约1.6×10^10转化子。 阅读提示：见Materials and Methods-Library construction, Table 1, Figure 2b |
| 噬菌体展示选择 | 靶标浓度：hIFNα-2b 320 nM，SARS-CoV-2 RBD 330 nM。淘选轮数：3轮。洗涤条件：第2轮和第3轮增加洗涤强度。磁珠：Dynabeads M-280。感染菌株：XL1Blue。 阅读提示：见Materials and Methods-Fab phage-display selection, Figure 5a |
| scFab酵母展示 | 转换方法：两步PCR，使用NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix。酵母株：EBY100。诱导和检测：流式细胞术。分选浓度：100 nM至0 nM。 阅读提示：见Materials and Methods-Two-step PCR conversion and scFab yeast display selection, Figure 6 |
| IgG转化 | 表达系统：Expi293F细胞。表达构建：线性表达盒（LEC）。转染后培养：5天。检测方法：ELISA。 阅读提示：见Materials and Methods-Assembly of LEC and expression, Figure 9 |
| 亲和力测定 | SPR设备：Carterra LSA-XT。固定相：抗人Fc抗体。抗原浓度系列：hIFNα-2b从300 nM至412 pM；RBD从100 nM至412 pM。结合模型：1:1。 阅读提示：见Materials and Methods-IgG validation: affinity determination, Figure 10a |
| 可开发性评估 | HIC条件：梯度洗脱，流动相A和B。SEC条件：等度洗脱，PBS缓冲液。Tm测定：UNcle系统，温度范围25-95°C。cGE：Labchip GX Touch，蛋白质清除HT试剂盒。DLS：Stunner，样品浓度0.5 mg/mL。 阅读提示：见Materials and Methods-IgG developability, Figure 10b-i |
