临床队列蛋白质组学筛选
鉴定tPA溶栓后血浆中差异表达蛋白
对10例AIS患者tPA治疗前后血浆进行DIA蛋白质组学分析，鉴定出119个DEPs，其中HRG显著升高；随后在157例患者中通过ELISA验证。
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富含组氨酸糖蛋白调节中性粒细胞和溶栓相关的出血性转化
Histidine-rich glycoprotein modulates neutrophils and thrombolysis-associated hemorrhagic transformation.
实验完整度
高包含临床队列蛋白质组学与ELISA验证、体外中性粒细胞功能实验、小鼠MCAO模型体内实验，以及RNA-seq和蛋白质组学机制验证。
主要模型
急性缺血性卒中患者血浆 人外周血中性粒细胞 人脑微血管内皮细胞（hCMEC/D3） 光栓性小鼠MCAO模型
重点核对
HRG在tPA输注后1小时在血浆中升高，但在随后发生HT的患者中未升高 HRG通过CLEC1B受体减少tPA诱导的中性粒细胞NETosis和炎症因子产生 HRG抑制中性粒细胞跨体外BBB模型迁移 小鼠MCAO模型中，延迟tPA治疗（5小时）联合HRG给药减少HT和神经功能缺损 HRG siRNA加重HT，而中性粒细胞耗竭或DNase I处理可逆转
摘要
重组组织型纤溶酶原激活剂（tPA）静脉溶栓仍然是急性缺血性卒中（AIS）患者的主要治疗方法。然而，tPA相关出血性转化（HT）的机制仍知之甚少。通过纳米液相色谱串联质谱法检测到，与tPA输注前基线相比，tPA输注后1小时富含组氨酸糖蛋白（HRG）表达升高（发现队列，n=10），随后通过ELISA在验证队列（n=157）中得到证实。令人惊讶的是，在随后发生HT的个体中未检测到HRG升高。在体外实验中，HRG减少了tPA诱导的中性粒细胞NETosis、炎症细胞因子产生和跨血脑屏障迁移。在光栓性小鼠AIS模型中，HRG给药通过抑制中性粒细胞免疫浸润和下调促炎信号通路，改善了延迟溶栓时的HT。中性粒细胞耗竭或NETosis抑制也减轻了HT，而HRG siRNA治疗加重了HT。总之，HRG水平的波动可能反映tPA治疗及其相关的HT。HRG对中性粒细胞的抑制作用可能抵消tPA诱导的AIS患者免疫异常和HT。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- tPA溶栓后血浆中HRG水平的变化及其对tPA相关出血性转化的影响和机制是什么？
- 核心机制
- HRG通过CLEC1B受体抑制中性粒细胞NETosis、炎症因子产生和跨血脑屏障迁移，并下调NOD样受体信号通路和NF-κB等促炎信号通路，从而减轻tPA相关出血性转化。
- 主要证据
- 发现队列（n=10）和验证队列（n=157）显示tPA后HRG升高，且HRG升高不足与HT风险增加相关；体外实验显示HRG抑制中性粒细胞NETosis、炎症因子和迁移；小鼠MCAO模型中HRG给药减轻延迟溶栓导致的HT和神经功能缺损。
- 研究意义
- 作者提出监测HRG水平可能作为预测和管理溶栓相关出血性转化的潜在靶点，并可能延长tPA治疗时间窗。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外中性粒细胞功能实验
研究HRG对tPA刺激的中性粒细胞存活、NETosis、炎症因子和迁移的影响
分离人外周血中性粒细胞，用tPA和HRG处理，检测细胞活力、NETosis、TNF-α/IL-8/ROS水平、F-actin聚合及跨体外BBB迁移。
小鼠MCAO模型体内验证
验证HRG对延迟溶栓诱导的HT和神经功能的影响
建立光栓性MCAO模型，于卒中后1小时或5小时给予tPA（10mg/kg），并在5小时组联合脑室内注射HRG，24小时后评估神经功能、脑出血量和中性粒细胞浸润。
信号通路机制分析
阐明HRG抑制中性粒细胞活化的分子机制
对tPA和tPA+HRG处理的中性粒细胞进行RNA-seq和蛋白质组学分析，鉴定差异表达基因和蛋白，并进行KEGG和GO富集分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白质组学 | UltiMate 3000UHPLC液相色谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Q-Exactive HF X质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Procell | PM150110 |
| 细胞活力检测 | 钙黄绿素-AM | Glpbio | GC34061 |
| 细胞核染色 | Hoechst 33342 | Solarbio | C0031 |
| 细胞培养 | 脂多糖 | Sigma-Aldrich | L8880 |
| 人脑微血管内皮细胞 | Zhongqiao Xinzhou Biotechnology | ZQ0961 | |
| 动物实验 | 玫瑰红 | Sigma-Aldrich | 330000 |
| 组织型纤溶酶原激活剂 | Boehringer Ingelheim | -- | |
| 重组富含组氨酸糖蛋白 | Sino Biological | 10836-H08H | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| 免疫荧光 | 抗组蛋白H3抗体 | Abcam | ab219407 |
| 抗髓过氧化物酶抗体 | Invitrogen | MA1-80878 | |
| 抗CLEC1A抗体 | Proteintech | 13394-1-AP | |
| 抗CLEC1B抗体 | Proteintech | 12814-1-AP | |
| Alexa-Fluor 488驴抗兔二抗 | Invitrogen | A-21206 | |
| Alexa-Fluor 594驴抗鼠二抗 | Invitrogen | A-32744 | |
| Alexa-Fluor 488标记的鬼笔环肽 | Invitrogen | A12379 | |
| 动物实验 | 抗小鼠Ly6G单克隆抗体 | Bio X Cell | BE0075-1 |
| 免疫荧光 | 大鼠抗Ly6G单克隆抗体 | Biolegend | 127605 |
| Western blot | 兔抗HRG抗体 | Proteintech | 26252-1-AP |
| 细胞培养 | EGM-2 MV培养基 | Lonza | Cc-3162 |
| 动物实验 | D-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | 158968 |
| 细胞分离 | 人中性粒细胞密度梯度分离试剂盒 | Solarbio | -- |
| 细胞培养 | 红细胞裂解液 | Solarbio | R1010 |
| ELISA | HRG ELISA试剂盒 | Sino Biological | KIT10836 |
| IL-8 ELISA试剂盒 | MEIMIAN | MM-50812H1 | |
| TNF-α ELISA试剂盒 | MEIMIAN | MM-50812H1 | |
| ROS检测试剂盒 | KeyGENBioTECH | KGT010 | |
| 细胞迁移 | Transwell膜插件 | Corning Life Science | -- |
| 动物实验 | 血红蛋白含量检测试剂盒 | Solarbio | BC5585 |
| qPCR | PerfectStart SYBR Green qPCR预混液 | Transgen | AQ601 |
| TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026CN | |
| siRNA递送 | EntransterTM体内转染试剂 | Engreen Biosystem Co, Ltd | 18668-11-1 |
| Western blot | SYPRO Ruby蛋白染色剂 | Life Technologies | -- |
| 增强化学发光系统 | Pierce Biotechnology | -- | |
| 蛋白质定量 | Bradford蛋白定量试剂盒 | Bio-Rad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者队列与血浆采集 | 患者纳入标准、tPA剂量、血浆采集时间点（基线、输注后1小时） 阅读提示：Methods: Patient cohort and plasma collection; Figure 2 |
| 中性粒细胞分离与培养 | 血液来源、密度梯度分离试剂盒、细胞纯度>98% 阅读提示：Methods: Isolation and culture of human peripheral blood neutrophils |
| 细胞活力与NETosis检测 | tPA浓度（10μg/ml）、HRG浓度（0.05-1μM）、刺激时间（2.5小时）、抗体阻断浓度 阅读提示：Methods: Neutrophil viability assay; In vitro NETosis assay; Figure 3, 4 |
| 体外BBB模型 | hCMEC/D3细胞系、Transwell孔径（3μm）、包被胶原IV和纤连蛋白浓度、氧糖剥夺时间（4小时） 阅读提示：Methods: In vitro model of the BBB and permeability assay; Figure 5 |
| 小鼠MCAO模型 | 小鼠品系（C57BL/6）、年龄、玫瑰红剂量（60mg/kg）、光照时间（25分钟）、tPA剂量（10mg/kg）、HRG给药方式（脑室内） 阅读提示：Methods: Photothrombotic stroke model and tPA thrombolysis; Figure 6 |
| 中性粒细胞耗竭与NETosis抑制 | 抗Ly6G剂量（8mg/kg）、DNase I剂量（5mg/kg） 阅读提示：Methods: Neutrophil depletion and DNase I treatment; Figure EV3 |