检测病毒感染对细胞内FBP水平的影响
评估病毒感染是否改变细胞内FBP含量。
用VSV感染293T细胞，HSV-1感染RAW264.7细胞，在不同时间点（6-12小时）测定细胞内FBP浓度。
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果糖-1,6-二磷酸通过促进HMGB1的溶酶体降解并阻断HMGB1与病毒基因组的结合来抑制病毒复制
Fructose-1,6-diphosphate inhibits viral replication by promoting the lysosomal degradation of HMGB1 and blocking the binding of HMGB1 to the viral genome.
实验完整度
高包含体外细胞实验（多细胞系）、体内小鼠模型、机制验证（溶酶体降解、结合阻断）及多种病毒（VSV、HSV-1、HCV）的证据层级。
主要模型
293T细胞 RAW264.7巨噬细胞 小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs） C57BL/6小鼠模型
重点核对
FBP浓度：1-5 mM用于抑制，10 μM低剂量促进感染 病毒感染MOI：VSV和HSV-1为0.1，HCV为0.01 处理时间：FBP预处理12 h，感染后检测时间点（VSV/HSV-1为10 h，HCV为72 h） 体内模型：C57BL/6小鼠，FBP剂量500 mg/kg（每12小时），VSV或HSV-1感染剂量2×10^8 PFU/只 溶酶体抑制剂：NH4Cl（10 mM）和3-MA（5 μM）恢复HMGB1水平
摘要
果糖-1,6-二磷酸（FBP），一种关键的糖酵解代谢物，因其在应激期间的细胞保护作用而闻名。然而，FBP在病毒感染中的作用尚不清楚。在这里，我们证明病毒感染细胞表现出升高FBP水平。外源性FBP在体外和体内均抑制RNA和DNA病毒感染。通过调节代谢酶FBP1和PFK1的表达来调节细胞内FBP水平，显著影响病毒感染。机制上，FBP的抑制作用并非由于病毒粘附或进入的改变，且在很大程度上不依赖于I型干扰素介导的免疫应答；相反，它们通过调节HMGB1发生。在病毒感染期间，FBP主要通过促进HMGB1的溶酶体降解来降低HMGB1蛋白水平。此外，FBP与HMGB1相互作用，并破坏HMGB1与病毒基因组的结合，从而进一步抑制病毒复制。我们的发现强调了FBP作为控制病毒感染的潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 果糖-1,6-二磷酸（FBP）在病毒感染中是否发挥作用及其分子机制是什么？
- 核心机制
- FBP通过促进HMGB1的溶酶体降解降低其蛋白水平，并直接与HMGB1结合阻断其与病毒基因组的相互作用，从而抑制病毒复制。
- 主要证据
- 体外实验显示FBP抑制VSV、HSV-1和HCV的复制，体内实验降低小鼠病毒载量和死亡率；敲低HMGB1消除FBP的抑制作用；FBP促进HMGB1溶酶体降解，并通过RIP和ChIP实验证明其阻断HMGB1与病毒核酸结合。
- 研究意义
- FBP作为一种糖酵解代谢物，具有作为广谱抗病毒治疗剂的潜力，为抗病毒药物研发提供新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
外源性FBP抑制病毒感染的体外实验
验证外源性FBP对RNA和DNA病毒感染的抑制作用。
用不同浓度FBP预处理多种细胞（RAW264.7、BMDMs、THP-1、293T、HLCZ01等）后感染VSV、HSV-1或HCV，检测病毒RNA/基因组和滴度。
外源性FBP抑制病毒感染的体内实验
评估FBP在体内的抗病毒效果。
C57BL/6小鼠腹腔注射FBP预处理后感染VSV或HSV-1，监测生存率和病毒载量。
内源性FBP水平的调控对病毒感染的影响
证实细胞内FBP浓度是影响病毒感染的关键因素。
通过敲低或过表达FBP1和PFK1改变细胞内FBP水平，随后感染VSV，检测病毒RNA水平。
验证FBP抑制病毒是否依赖I型干扰素信号
明确FBP的抗病毒作用是否通过I型干扰素通路。
检测FBP处理后IFN-β表达水平，并使用IFNAR1敲除细胞和Huh7.5细胞评估FBP的抑制效果。
鉴定HMGB1在FBP抗病毒作用中的必要性
确定HMGB1是否为FBP介导的抗病毒作用所必需。
通过siRNA或shRNA敲低HMGB1或HMGB2，评估FBP对VSV、HSV-1和HCV复制的抑制效果。
研究FBP对HMGB1蛋白水平的影响及降解途径
阐明FBP降低HMGB1蛋白水平的机制。
检测FBP处理后HMGB1 mRNA和蛋白水平，并使用蛋白质合成抑制剂CHX和溶酶体/蛋白酶体抑制剂处理。
验证FBP阻断HMGB1与病毒基因组的结合
证明FBP干扰HMGB1与病毒核酸的相互作用。
使用RIP和ChIP实验检测FBP对HMGB1与病毒RNA/基因组结合的影响，并通过resin pulldown和His pulldown验证FBP与HMGB1的直接结合。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
细胞培养与病毒感染
RNA和DNA检测
蛋白质相互作用分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清（FBS） | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 地塞米松 | Sigma | -- | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS） | Lonza | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 293T转染试剂 | Beyotime | -- |
| Via-Fect转染试剂 | Promega | -- | |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| RNA干扰 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA提取与qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 逆转录系统 | Bimake | -- | |
| SYBR Green PCR预混液 | Bimake | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| PVDF膜 | Merck Millipore | -- | |
| SuperSignal West Pico化学发光底物 | Pierce | -- | |
| ELISA | 小鼠IFN-β ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | -- | -- |
| 山羊血清 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| DAPI | Vector Laboratories | -- | |
| 共聚焦显微镜 | Nikon | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | ApexBio Technology | -- |
| 细胞内FBP或乳酸测量 | FBP ELISA试剂盒 | Solarbio | BC2245 |
| 乳酸检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K044-M | |
| His pulldown | TALON金属亲和树脂 | Takara | 635503 |
| ChIP | SimpleChip Plus超声染色质IP试剂盒 | Cell Signaling | #56383 |
| 抗体 | 抗HMGB1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-56698 |
| 抗HCV-NS3抗体 | Abcam | ab13830 | |
| 肌动蛋白抗体 | Sigma | A5541 | |
| 抗VSV-G抗体 | Abcam | ab183497 | |
| 抗p-TBK1抗体 | CST | #5483 | |
| 抗TBK1抗体 | CST | #3504 | |
| 抗p-IRF3抗体 | CST | #4947 | |
| 抗IRF3抗体 | CST | #4302 | |
| 抗p-STAT1抗体 | ProteinTech | #10501-1-AP | |
| 抗STAT1抗体 | CST | #14994S | |
| 抗p-STAT2抗体 | Sangon Biotech | D155166-0025 | |
| 抗STAT2抗体 | Sangon Biotech | D261445-0025 | |
| 抗微管蛋白抗体 | Abcam | ab7792 | |
| 抗FBP1抗体 | Boster | 514824 | |
| 抗PFKP抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-514824 | |
| FLAG标签抗体 | Sigma-Aldrich | #F1804 | |
| 山羊抗小鼠IgG（HRP偶联） | Merck Millipore | AP124P | |
| 山羊抗兔IgG（HRP偶联） | Merck Millipore | AP307P | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 488偶联二抗 | Thermo Fisher Scientific | R37120 |
| 慢病毒包装 | psPAX2包装质粒 | -- | -- |
| pMD2G包膜质粒 | -- | -- | |
| His pulldown | 纯化HMGB1蛋白 | Sino Biological | 10326-H08H |
| HCV-SL4 RNA序列 | Synbio technology | -- | |
| RNA提取与qPCR | MEGAscript体外转录试剂盒 | Ambion | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系（293T、RAW264.7、Huh7.5、HLCZ01等）的培养基和添加剂（如FBS浓度、非必需氨基酸） 阅读提示：Materials and methods - Cells, plasmids and viruses |
| 病毒扩增与感染 | 病毒株（VSV、HSV-1、HCV JFH1）的来源、MOI、感染时间和温度；FBP浓度和预处理时间 阅读提示：Materials and methods - Cells, plasmids and viruses; Figure legends 1-6 |
| FBP处理 | FBP浓度（1-5 mM）和预处理时间（12小时）；体内给药剂量（500 mg/kg）和频率（每12小时） 阅读提示：Materials and methods - Viral infection in vivo; Figure legends 1-3 |
| 基因沉默/过表达 | siRNA或shRNA靶序列、转染试剂和条件；质粒构建（FBP1、PFKP、HMGB1截短体） 阅读提示：Materials and methods - RNA interference, Cell transfection, Lentivirus production |
| 蛋白降解检测 | 抑制剂（MG132、NH4Cl、3MA）浓度和处理时间；CHX浓度和处理时间 阅读提示：Figure legends 5, S4 |
| 结合实验 | RIP和ChIP实验的抗体、交联条件、洗涤和洗脱条件；His pulldown中蛋白和RNA浓度 阅读提示：Materials and methods - RIP assay, ChIP assay, His pulldown assay |
| 体内实验 | 小鼠品系、年龄、性别、环境条件（光照、温度）、FBP和病毒注射途径、安乐死时间 阅读提示：Materials and methods - Ethics statement, Viral infection in vivo |
| 统计分析 | 样本量、独立实验次数、统计学方法（t检验、ANOVA、log-rank） 阅读提示：Materials and methods - Statistical analysis |