血液ILCs和NK细胞的单细胞转录组分析
鉴定血液中ILC1s的存在及其转录特征。
使用EasySep Human Pan-ILC Enrichment Kit富集血液Lin−CD127+CD161+细胞，FACS纯化后scRNA-seq；同时分选CD3−CD56+ NK细胞进行scRNA-seq。
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人类组织中1型固有淋巴细胞（ILC1）的多样性
Diversity of group 1 innate lymphoid cells in human tissues
实验完整度
高研究包含多组织样本的scRNA-seq、流式细胞术、体外刺激实验、跨数据集模块评分分析及细胞间通讯预测，涵盖表型、功能及机制验证。
主要模型
人外周血单个核细胞（PBMC） 人扁桃体组织细胞 人肺组织细胞（健康供体和肺纤维化患者） 人肠道上皮内淋巴细胞（IEL）和固有层淋巴细胞（LPL）
重点核对
血液ILCs通过EasySep Human Pan-ILC Enrichment Kit富集Lin−CD127+CD161+细胞，随后FACS去除残留B、T和NK细胞。 扁桃体CD56+细胞通过CD56微磁珠阳性选择富集，分为NKp44+和NKp44−亚群。 肺组织细胞从器官捐献者和肺纤维化移植受者中获取，经胶原酶IV消化。 肠道IEL分离使用EDTA和DTT处理，LPL经胶原酶IV消化和Percoll密度梯度离心。 scRNA-seq使用10x Genomics平台3'，版本v2或v3，数据通过Cell Ranger比对至GRCh38参考基因组。
摘要
1型固有淋巴细胞（ILC1s）是缺乏抗原特异性受体的细胞毒性及产生干扰素-γ的淋巴细胞，包括ILC1s和自然杀伤（NK）细胞。在小鼠中，ILC1s与NK细胞不同，它们独立于NK特异性转录因子EOMES发育，而需要抑制因子ZFP683（人类中的ZNF683）以实现组织驻留。在此，我们通过单细胞RNA测序和流式细胞术研究人类ILC1多样性，发现不同组织中的ILC1亚型高度可变。肠道上皮含有丰富的成熟EOMES− ILC1s，表达PRDM1而非ZNF683，同时存在少量未成熟TCF7+PRDM1− ILC1s。其他组织含有表达ZNF683和EOMES转录本的NK细胞；然而，EOMES蛋白含量是可变的。这些ZNF683+ NK细胞是组织印记的NK细胞，表型上类似ILC1s。组织ILC1-NK频谱还包括常规NK细胞和以PTGDS表达为特征的NK细胞。这些发现为评估疾病中NK-ILC1频谱内的表型和功能变化奠定了基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人类组织中1型固有淋巴细胞（ILC1）的异质性及其与NK细胞的区别是什么？
- 核心机制
- 组织微环境（如TGF-β、缺氧）可能诱导NK细胞上调ZNF683并下调EOMES蛋白，使其表现出ILC1样表型；肠道上皮中成熟ILC1s表达PRDM1而非ZNF683，维持组织驻留。
- 主要证据
- 通过scRNA-seq和流式细胞术分析血液、扁桃体、肺和肠道组织，鉴定出肠道PRDM1+ ieILC1s、扁桃体和肺ZNF683+ NK细胞，并通过模块评分和相关性分析发现它们与decidual、肝和肿瘤ILC1s的相似性。
- 研究意义
- 该研究为区分人类ILC1s与NK细胞亚群提供了资源，有助于评估疾病中NK-ILC1频谱的表型和功能变化，为相关疾病的免疫治疗提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
扁桃体ILCs和NK-ILC1细胞的单细胞转录组分析
鉴定扁桃体中ILC1样细胞的特征。
使用pan-ILC富集和CD56阳性选择，分选CD3−CD19−CD56+NKp44+和NKp44−细胞进行scRNA-seq，并通过流式验证EOMES、T-BET和CD49a表达。
肺NK/ILC1细胞的单细胞转录组分析及纤维化比较
比较健康肺和纤维化肺中NK/ILC1细胞亚群的变化。
分选肺CD45+CD3−CD19−CD14−细胞进行scRNA-seq，比较对照和纤维化供体，通过流式验证CD56+CD103+细胞扩增。
肠道上皮内ILC1/NK细胞的单细胞转录组分析
鉴定肠道上皮内的ILC1亚群及其与NK细胞的区别。
分选CD45+CD3−CD19− IEL和CD45+CD3−CD19−NKp44+CD103+细胞进行scRNA-seq，通过流式验证PRDM1+ ILC1s的表型。
肠道IEL和LPL的细胞组成比较
比较肠道上皮和固有层中ILC1和ILC3的分布差异。
同一供体分选IEL和LPL细胞进行scRNA-seq，分析不同细胞类型丰度。
跨组织数据库模块评分分析
验证ILC1亚群在其他组织中的相似性。
将本研究的NK/ILC1亚群与decidual、肝、肿瘤和CTICA数据库中的细胞类型进行模块评分和相关性分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞分离和富集 | EasySep 人泛ILC富集试剂盒 | StemCell Technologies | -- |
| 细胞分离 | CD56 微磁珠 | Miltenyi | -- |
| 细胞消化 | IV型胶原酶 | Sigma | C-5138 |
| 细胞培养 | RPMI培养基 | -- | -- |
| Hank's平衡盐溶液 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 二硫苏糖醇 | -- | -- | |
| 细胞分离 | Percoll | -- | -- |
| 细胞刺激 | 植物血凝素 | -- | -- |
| 白细胞介素-2 | -- | -- | |
| 佛波酯 | -- | -- | |
| 离子霉素 | -- | -- | |
| 细胞激活鸡尾酒 | BioLegend | 423302 | |
| 高尔基体阻断剂 | -- | -- | |
| 流式细胞术 | Layilin生物素 | Sino Biological | 10208-MM02 |
| CD39-FITC抗体 | BioLegend | 328206 | |
| CD19-PerCP抗体 | BioLegend | 302230 | |
| CD103-BV421抗体 | BioLegend | 350213 | |
| CD45-AF700抗体 | BioLegend | 368514 | |
| TCRγδ-PE-Cy7抗体 | BioLegend | 331221 | |
| CD3-BV510抗体 | BioLegend | 300447 | |
| NKp46-BV510抗体 | BioLegend | 331923 | |
| CD127-BV510抗体 | BioLegend | 351331 | |
| NKp46-BV605抗体 | BioLegend | 331925 | |
| TCF1-PE抗体 | BioLegend | 655207 | |
| CD49a-FITC抗体 | BioLegend | 328307 | |
| NKp80-PE抗体 | BioLegend | 346706 | |
| NKp44-PE-Cy7抗体 | BioLegend | 325115 | |
| CD127-BV605抗体 | BioLegend | 351333 | |
| CRTH2-Alexa Fluor 647抗体 | BioLegend | 350104 | |
| CD127-BV421抗体 | BioLegend | 351309 | |
| CD103-Alexa Fluor 488抗体 | BioLegend | 3500208 | |
| 颗粒溶素-Alexa Fluor 647抗体 | BioLegend | 348006 | |
| 颗粒酶A-PE抗体 | BioLegend | 507206 | |
| CD56-APC-Cy7抗体 | BioLegend | 318331 | |
| CD3-BV605抗体 | BioLegend | 317322 | |
| 链霉亲和素-PE-Cy7 | BioLegend | 405206 | |
| TNFα-PE-Cy7抗体 | BioLegend | 502929 | |
| IFNγ-APC抗体 | BioLegend | 502512 | |
| 链霉亲和素-PE | BioLegend | 554061 | |
| CD56-PE抗体 | BioLegend | 304606 | |
| CD14-PerCP抗体 | BioLegend | 550787 | |
| CD3-PerCP抗体 | BioLegend | 344814 | |
| CD4-FITC抗体 | BioLegend | 564420 | |
| CD56-PerCP抗体 | BioLegend | 560842 | |
| CD45-APC抗体 | eBioscience | 17-0459-42 | |
| CD161-PE抗体 | eBioscience | 12-1619-42 | |
| EOMES-Alexa Fluor 647抗体 | eBioscience | 51-4877-41 | |
| TCRαβ-生物素 | eBioscience | 13-9986-82 | |
| T-BET-PE抗体 | eBioscience | 12-5825-82 | |
| CD8a-APC抗体 | eBioscience | 17-0088-42 | |
| CD45-BUV395抗体 | BD | 563791 | |
| CD3-BUV661抗体 | BD | 565066 | |
| 7-AAD | BD | 559925 | |
| NKp44-PE抗体 | BD | 558563 | |
| BD FACS Aria II 分选仪 | BD | -- | |
| BD FACS LSR Fortessa X20 流式细胞仪 | BD | -- | |
| BD Symphony A3 流式细胞仪 | BD | -- | |
| scRNA-seq | 10x Genomics 3' 平台 | 10x Genomics | -- |
| Cell Ranger | 10x Genomics | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 血液ILCs富集 | 使用EasySep Human Pan-ILC Enrichment Kit富集，FACS分选CD45+Lin−CD161+CD127+细胞；两例供体 阅读提示：Methods: Preparation of single-cell suspension from human samples; 图1a |
| 扁桃体ILCs和NK细胞分选 | pan-ILC富集和CD56阳性选择，分选CD3−CD19−CD56+NKp44+和NKp44−细胞；供体数量：pan-ILC两例，NKp44+四例，NKp44−两例 阅读提示：Methods: Preparation of single-cell suspension from human samples; 图2c |
| 肺组织处理 | 胶原酶IV (1 mg/ml) 37°C消化45分钟；供体来源：器官捐献者和纤维化移植受者 阅读提示：Methods: Preparation of single-cell suspension from human samples; 图3a |
| 肠道IEL和LPL分离 | IEL用HBSS含10% FCS和5 mM EDTA提取，DTT 5 mM；LPL用胶原酶IV消化；Percoll梯度离心 阅读提示：Methods: Preparation of single-cell suspension from human samples; 图4a,k |
| 体外刺激 | CD4+或CD8+细胞用PHA、IL-2和辐照饲养细胞扩增10-12天；刺激后检测IFNγ和TNF 阅读提示：Methods: In vitro stimulation |