从肝脏分离溶酶体亚群
获得富含溶酶体的组分并分离成轻和重亚群。
使用Histodenz不连续梯度离心，从鼠肝匀浆中分离溶酶体。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
使用Histodenz分离溶酶体亚群以分析分子伴侣介导的自噬
Histodenz Separation of Lysosomal Subpopulations for Analysis of Chaperone-mediated Autophagy.
实验完整度
中文献提供详尽的实验方案和验证实验（如Western blot富集分析、CMA底物摄取、膜完整性），但缺少多层级功能验证。
主要模型
小鼠肝脏 AML12细胞
重点核对
小鼠品系和性别（如UM-HET3） 禁食时间（如18小时） 细胞汇合度（90-100%） 氮气压力（500 psi） 离心条件（39,000 RPM, 2小时, 4°C）
摘要
分子伴侣介导的自噬(CMA)是溶酶体蛋白水解中最具选择性的形式，其中蛋白质被单独选择用于溶酶体降解。CMA降解靶标带有五肽共有基序，该基序被胞质伴侣HSPA8(Hsc70)识别，后者参与将靶标转运至溶酶体表面。从那里，它被转运到溶酶体腔内，不依赖于囊泡融合，该过程依赖于溶酶体跨膜蛋白LAMP2A。用于研究全细胞和组织中CMA的工具有限，许多研究CMA的最佳技术依赖于富含溶酶体组分的制备。此类实验包括(1)体外评估CMA底物摄取活性，(2)表征溶酶体驻留蛋白和CMA调节蛋白的变化，以及(3)溶酶体靶标组学，即使用定量蛋白质组学表征溶酶体降解靶标。先前使用不连续的metrizamide梯度的研究表明，肝溶酶体的一个亚群负责大部分CMA活性(“CMA+”)。这些“CMA+”溶酶体密度低，相对于“CMA-”溶酶体具有更高水平的MTORC2，而“CMA-”溶酶体密度高，具有更高水平的MTORC1。由于围绕metrizamide的安全问题，该化合物难以获得，且价格高得令人望而却步。在这里，我们提供了从小鼠肝脏使用Histodenz(一种安全且价格合理的metrizamide替代品)分离用于CMA相关分析的溶酶体亚群的方案。补充方案展示了如何进行具有适当统计分析的CMA活性测定，以及如何分析溶酶体破裂/膜完整性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何用Histodenz替代metrizamide来分离具有CMA活性的溶酶体亚群？
- 核心机制
- 文中未明确说明
- 主要证据
- 通过Western blot验证溶酶体标志物（CTSB）的富集，以及CMA底物摄取实验和膜完整性测定。
- 研究意义
- 提供了安全、经济的方法来重复和扩展早期CMA研究。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
从培养细胞分离溶酶体
评估Histodenz梯度在培养细胞中分离溶酶体的效果。
使用氮气空化裂解AML12细胞，然后进行不连续Histodenz梯度离心。
验证溶酶体标记物富集
确认分离的溶酶体组分中溶酶体蛋白的富集和纯度。
通过Western blot检测LAMP2A、LAMP1、CTSB等标志物，并评估细胞器污染。
体外CMA底物摄取测定
评估分离溶酶体的CMA活性。
将溶酶体与MAPT底物在ATP和HSPA8存在下共孵育，检测MAPT的摄取。
溶酶体膜完整性测定
确保溶酶体膜完整以准确测量底物摄取。
通过己糖胺酶释放实验检测膜的破裂。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Histodenz | Sigma | D2158 |
| 离心分离 | 超清离心管 | Beckman Coulter | 344057 |
| 细胞裂解 | 细胞破碎腔 | Parr Instruments | 04-731-50 |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | ThermoFisher | 23227 |
| Western blot | 抗LAMP2A抗体 | AbCam | ab125068 |
| 抗LAMP1抗体 | AbCam | ab24170 | |
| 抗CTSB抗体 | Cell Signaling Technology | 31718S | |
| 抗MTOR抗体 | Cell Signaling Technology | 2972S | |
| 总OXPHOS抗体混合物 | AbCam | MS604-300 | |
| 抗RICTOR抗体 | Cell Signaling Technology | 2214S | |
| 抗RAPTOR抗体 | Cell Signaling Technology | 2280S | |
| 抗TUBA抗体 | Cell Signaling Technology | 2144S | |
| 抗H3抗体 | AbCam | ab176842 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体 | AbCam | ab6721 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG多克隆抗体 | AbCam | ab6789 | |
| EcoBright Femto底物 | InnovSol | EBFH100 | |
| 细胞培养 | 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | 未明确 | -- |
| 胎牛血清 | 未明确 | -- | |
| 青霉素-链霉素 | 未明确 | -- | |
| 胰蛋白酶-EDTA | 未明确 | -- | |
| 细胞裂解 | 蔗糖 | Fisher | BP220 |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| Protein quantification | Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | ThermoFisher | 23225 |
| Kit | 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma | 11836153001 |
| PhosSTOP磷酸酶抑制剂 | Roche | 04906845001 | |
| NuPage LDS上样缓冲液 | Invitrogen | NP0007 | |
| Gel | 4-20%梯度胶 | BioRad | 4561096 |
| Marker | 双色蛋白分子量标准 | BioRad | 1610374 |
| Running buffer | Tris/甘氨酸/SDS电泳缓冲液 | BioRad | 1610732 |
| Transfer buffer | Tris/甘氨酸转膜缓冲液 | BioRad | 1610734 |
| Western blot | TBS缓冲液 | BioRad | 1706435 |
| 吐温 | Sigma | P1379 | |
| 脱脂奶粉 | Research Products International | M17200 | |
| PVDF膜 | BioRad | 1620177 | |
| CMA uptake | MAPT摄取实验缓冲液 | -- | -- |
| 空白摄取实验缓冲液 | -- | -- | |
| MAPT蛋白 | Sino Biological | 10058-H07E | |
| HSPA8蛋白 | AbCam | 78431 | |
| ATP | Sigma | A2383 | |
| Membrane integrity | 比色己糖胺酶缓冲液 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠肝脏溶酶体分离 | 小鼠品系、性别、年龄、禁食时间 阅读提示：Basic Protocol 1, Materials, 步骤1-5 |
| Histodenz梯度制备 | Histodenz浓度（88.38%母液）、梯度层浓度、体积 阅读提示：Fig 1A, 步骤1-2 |
| 离心分离 | 离心机型号、转子（SW55Ti或SW50.1）、转速（39,000 RPM）、时间（2小时）、温度（4°C） 阅读提示：Basic Protocol 1, 步骤19 |
| 培养细胞溶酶体分离 | 细胞类型（AML12）、汇合度（90-100%）、氮气压力（500 psi）、细胞破碎腔型号 阅读提示：Alternate Protocol 1, 步骤8-9 |
| CMA底物摄取测定 | 溶酶体浓度、MAPT浓度、HSPA8浓度、ATP浓度、孵育时间（20分钟和10分钟） 阅读提示：Support Protocol 2, 步骤4-10 |
| 膜完整性测定 | 破裂比例阈值（>10%排除） 阅读提示：Support Protocol 3, 步骤5 |