开发HepG4-seq方法检测天然G4
开发一种不依赖抗体的方法，用于在活细胞中特异性标记和检测内源G4。
利用G4-hemin复合物的过氧化物酶活性，在H2O2存在下催化生物素-苯胺（Bio-An）对G4及其邻近DNA的生物素化，然后通过mSA-scFv和Tn5进行CUT&Tag。
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活细胞中天然共定位G4和R-loop的全基因组图谱
Genome-wide mapping of native co-localized G4s and R-loops in living cells.
实验完整度
高包含HepG4-seq、HBD-seq、RNA-seq、Dhx9 CUT&Tag等全基因组测序，以及细胞增殖、细胞周期、Western blot、免疫荧光和胚胎体分化等功能验证，形成多层级证据。
主要模型
HEK293细胞 小鼠胚胎干细胞（mESCs） Dhx9敲除mESCs（dhx9KO） 小鼠胚胎体（EBs）
重点核对
HepG4-seq标签条件：25 µM hemin、500 µM Bio-An处理2小时，1 mM H2O2激活1分钟 Dhx9敲除mESC系构建及验证（Western blot和免疫荧光） Dhx9 CUT&Tag抗体（ABclonal A4563）及浓度（0.04 µg per 1×10^5 cells） 细胞处理：ML216（25 µM）或NSC617145（3 µM）处理HEK293细胞16小时 生物信息学分析参数：SEACR峰值调用（0.05 non-stringent），差异分析阈值（p<0.05，FC≥1.5）
摘要
G4和R-loop之间的相互作用在调控DNA修复、复制和转录中日益受到关注。目前缺乏对活细胞中天然共定位G4和R-loop的综合图像。在此，我们描述了HepG4-seq的发展和优化的HBD-seq方法，它们分别稳健捕获活细胞中的天然G4和R-loop。我们成功应用这些方法建立了人HEK293细胞和小鼠胚胎干细胞（mESCs）中天然共定位G4和R-loop的综合图谱。我们发现共定位G4和R-loop以细胞类型依赖的方式动态改变，并且主要定位于转录活跃基因的活性启动子和增强子。我们进一步证明了解旋酶Dhx9是调节共定位G4和R-loop形成和消解的直接和主要调节因子。Dhx9的缺失通过改变共定位G4和R-loop相关基因的转录，损害了mESCs的自我更新和分化能力。总之，我们的工作确立了内源性共定位G4和R-loop普遍存在于活性基因的调控区域，并参与其连锁基因的转录调控，为探索共定位G4和R-loop在发育和疾病中的更广泛作用打开了大门。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 活细胞中天然共定位的G4和R-loop的全基因组分布、动态变化及其调控机制是什么？
- 核心机制
- Dhx9解旋酶直接结合并调控共定位G4和R-loop的形成与消解，从而影响其相关基因的转录，进而调控mESC的自我更新和分化。
- 主要证据
- HepG4-seq和HBD-seq在HEK293和mESC中绘制共定位图谱，Dhx9 CUT&Tag显示约70%共定位峰被Dhx9直接结合；Dhx9敲除改变约6200个Dhx9结合的共定位峰，并导致相关基因差异表达；细胞增殖、细胞周期和EB分化实验证实功能影响。
- 研究意义
- 揭示了共定位G4和R-loop在活性基因调控区域的普遍性及其转录调控作用，为理解其在发育和疾病中的功能提供了基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证HepG4-seq特异性
验证HepG4-seq捕获的是真正的G4结构。
通过免疫荧光验证标记的特异性；通过BG4 CUT&Tag确认hemin处理不显著改变G4水平；通过pqsfinder预测的PQS和HOMER基序分析评估富集。
开发优化的HBD-seq方法检测R-loop
开发优化的R-loop检测方法，避免GST融合蛋白聚集问题。
表达纯化HBD-V5（EGFP-2xHBD-V5），利用V5抗体进行CUT&Tag。
绘制HEK293和mESC中共定位G4和R-loop图谱
识别细胞中天然共定位的G4和R-loop区域。
对HEK293和mESC进行HepG4-seq和HBD-seq，通过生物信息学交集分析共定位峰。
分析共定位G4和R-loop的基因组分布和转录关联
了解共定位G4和R-loop在基因组上的位置及其与转录活性的关系。
使用HOMER注释峰分布，进行metagene分析，结合RNA-seq和组蛋白修饰ChIP-seq数据（H3K4me3、H3K27ac等）分析关联。
研究Dhx9对共定位G4和R-loop的调控
探究解旋酶Dhx9是否直接调控共定位G4和R-loop的形成和消解。
通过CRISPR/Cas9生成dhx9KO mESC系，进行HepG4-seq和HBD-seq比较WT和KO，并进行Dhx9 CUT&Tag。
验证Dhx9对mESC细胞命运的影响
验证Dhx9缺失是否影响mESC的自我更新和分化能力。
通过细胞增殖实验（CCK-8）、细胞周期分析（流式）、EB分化实验、qRT-PCR检测多能性标志物。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
验证机制链路
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 活细胞标记 | 氯化血红素 | Sigma | 51280 |
| 生物素-苯胺 | Iris Biotech | LS-3970 | |
| 抗体 | 抗Dhx9（兔单克隆抗体） | ABclonal | A4563 |
| 抗GAPDH（小鼠单克隆抗体） | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 抗Nanog（兔单克隆抗体） | Proteintech | 14295-1-AP | |
| 抗Nanog（小鼠单克隆抗体） | Developmental Studies Hybridoma Bank (DHSB) | PCRP-NANOGP1-2D8 | |
| 抗Oct4（小鼠单克隆抗体） | Santa Cruz | sc-5279 | |
| 抗Lin28a（兔单克隆抗体） | Proteintech | 11724-1-AP | |
| 抗兔IgG（H+L）HRP（山羊多克隆抗体） | Bioss | bs-0295G-HRP | |
| 抗小鼠IgG（H+L）HRP（山羊多克隆抗体） | SinoBiological | SSA007 | |
| 抗小鼠IgG（H+L）Alexa Fluor 488（驴多克隆抗体） | Invitrogen | A-21202 | |
| 重组蛋白 | 链霉亲和素-Alexa647 | Bioss | bs-0437P-AF647 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Sigma | D5671 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099-141 | |
| 非必需氨基酸溶液 | Sigma | M7145 | |
| GlutaMAX补充剂 | Sigma | G8541 | |
| β-巯基乙醇 | Sigma | M3148 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| 小分子处理 | ML216 | Selleck | S0469 |
| NSC 617145 | MCE | HY-110185 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| RT-qPCR | MonScript RTIII All-in-One Mix逆转录试剂盒 | Monad | MR05101M |
| SYBR Green PCR预混液 | -- | -- | |
| 细胞周期分析 | DAPI染色液 | -- | -- |
| RNase A | NEB | T3018-2 | |
| 细胞增殖 | CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒 | Solarbio | CA1210 |
| 免疫荧光 | Hoechst33342染料 | -- | -- |
| RNA-seq | poly(A) mRNA捕获模块 | ABclonal | RK20340 |
| Fast RNA-seq文库构建试剂盒V2 | ABclonal | RK20306 | |
| NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- | |
| HepG4-seq | 伴刀豆球蛋白A包被磁珠 | Epizyme Biotech | YJ012 |
| 过氧化氢 | -- | -- | |
| HBD-seq | RNase H | NEB | M0297S |
| Dhx9 CUT&Tag | 抗V5抗体 | Sino Biological | 100378-T36 |
| 抗兔IgG抗体 | Sino Biological | SSA018 | |
| EB分化 | 抗坏血酸 | Sigma | A4544 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| HepG4-seq | 标记条件：hemin和Bio-An浓度及孵育时间（25 μM hemin、0.5 mM Bio-An孵育2小时），H2O2浓度及反应时间（1 mM，1分钟），细胞数量和磁珠结合条件 阅读提示：Materials and methods 下 'HepG4-seq' 小节 |
| HBD-seq | 重组HBD-V5浓度（3 μg per 1×10^5 cells），anti-V5抗体浓度（2 μg），洗涤条件 阅读提示：Materials and methods 下 'BG4-seq, HBD-seq' 小节 |
| Dhx9 CUT&Tag | Dhx9抗体浓度（0.04 μg per 1×10^5 cells），固定时间（0.1%甲醛2分钟） 阅读提示：Materials and methods 下 'Dhx9 CUT&Tag' 小节 |
| dhx9KO mESC建立 | sgRNA序列（ATCAGAGGTGTCGCTAAGTA和GAAGGGTTACCAGCACCAAT），转染方法（Nucleofector 2b），筛选浓度（G418 400 µg/ml，puromycin 1 µg/mL） 阅读提示：Materials and methods 下 'Generation of Dhx9KO ESCs with CRISPR/Cas9 genome editing' 小节 |
| EB分化 | 分化培养基（EB-Diff培养基无LIF）、细胞密度（10,000 cells/mL）、抗坏血酸浓度（50 µg/mL）、培养时间（5天） 阅读提示：Materials and methods 下 'mESC differentiation into embryoid bodies' 小节 |