通过IEDDA介导的位点特异性白蛋白偶联增强抗体片段的治疗潜力

单链可变片段（scFv）在治疗人类疾病（如癌症和免疫系统疾病）方面引起了广泛关注。然而，scFv的一个关键缺点是其极短的血清半衰期，这限制了其治疗潜力。因此，迫切需要延长scFv的血清半衰期以用于临床。人血清白蛋白（HSA）是一种有前景的蛋白质治疗药物血清半衰期延长剂，它是人血清中含量最丰富的蛋白质，以其极长的血清半衰期而闻名。然而，将大分子半衰期延长剂偶联到scFv这样的小蛋白上，通常会导致其关键特性显著丧失。本研究将HSA偶联到scFv的允许位点以改善药代动力学特征。为确保HSA偶联后对抗原结合能力的损伤最小，我们采用了使用异双功能交联剂的位点特异性偶联方法，该交联剂促进硫醇-马来酰亚胺反应和逆电子需求Diels-Alder反应（IEDDA）。作为模型蛋白，我们选择了源自曲妥珠单抗的4D5scFv，该抗体用于HER2阳性乳腺癌治疗。我们在计算方法预测的偶联位点引入了含有高反应性四嗪基团的苯丙氨酸类似物（frTet）。使用连接子TCO-PEG4-MAL，将单个HSA分子位点特异性偶联到4D5scFv（4D5scFv-HSA）。4D5scFv-HSA偶联物表现出与未修饰4D5scFv相当的HER2结合亲和力。此外，在小鼠药代动力学研究中，4D5scFv-HSA的血清半衰期约为12小时，比4D5scFv长85倍。4D5scFv-HSA的抗原结合结果和药代动力学特征表明，位点特异性白蛋白偶联的scFv保留了结合亲和力并延长了血清半衰期。总之，我们开发了一种制备位点特异性白蛋白偶联4D5scFv的有效策略，该策略具有多种临床应用潜力并提高疗效。