免疫与酵母展示文库构建
从免疫骆驼中获取靶向EGFR的VHH抗体片段库。
使用重组人可溶性EGFR ECD免疫两只骆驼，提取总RNA并合成cDNA，通过同源重组在S. cerevisiae EBY100细胞中构建酵母表面展示VHH文库。
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发现抑制EGFR的强效变构抗体
Discovery of potent allosteric antibodies inhibiting EGFR.
实验完整度
高包含从抗体发现、生化结合分析、细胞功能实验到信号通路验证的多个层级，并进行了体内外模型验证。
主要模型
EGFR表达的三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-468 酵母表面展示VHH文库 报告基因细胞系（SRE Reporter – HEK293）
重点核对
EGF Fc融合蛋白与EGFR的预孵育比例（3:1）及时间（1.5小时于室温） FACS分选策略中的双重门控设置及后续严格门控条件 抗体的EC50和IC50值测定，特别是30555_A2在MAPK/ERK通路中的IC50为38.2 pM 细胞实验中bEGF的浓度（100 nM）及抗体处理的浓度范围
摘要
在这项工作中，我们报道了通过结合骆驼科免疫和荧光激活细胞分选（FACS）发现强效的抗表皮生长因子受体（EGFR）变构重链抗体。在免疫和酵母表面展示文库构建后，通过引入标记的EGF Fc融合蛋白作为FACS的附加标准来获得变构克隆。这种分选方法使得鉴定出11种不与正构配体EGF竞争结合EGFR的重链抗体成为可能。这些抗体以皮摩尔至纳摩尔范围的亲和力结合表达EGFR的三阴性乳腺癌细胞系。这些骆驼科来源的抗体还通过调节EGFR对EGF的亲和力展现出有趣的特性。此外，它们还能够抑制EGF诱导的下游信号通路。特别地，我们鉴定出一个克隆在抑制PI3K/AKT和MAPK/ERK通路方面比已批准的阻断抗体西妥昔单抗更有效。我们的结果表明，变构抗体可能是治疗的新潜在模式。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探索能否通过变构位点靶向EGFR，发现比现有竞争性抗体更有效的单克隆抗体。
- 核心机制
- 变构抗体通过结合EGFR的非配体结合位点，负性调节EGF与EGFR的结合，并抑制EGF诱导的下游信号通路（PI3K/AKT和MAPK/ERK）。
- 主要证据
- 通过FACS筛选获得的11种抗体，FP和细胞实验显示多数抗体降低EGF结合，其中30555_A2在MAPK/ERK和PI3K/AKT通路抑制上优于西妥昔单抗。
- 研究意义
- 研究表明变构抗体可能成为新的治疗模式，尤其在靶向EGFR的癌症治疗中具有更高效力和高选择性优势。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
FACS筛选非竞争性结合剂
筛选不与EGF竞争结合EGFR的抗体克隆。
将EGFR与EGF Fc预孵育，通过三色标记（抗HA、抗His、抗Fc）进行FACS分选，选择在存在EGF情况下仍结合EGFR的细胞，并在后续轮次中采用更严格的门控。
抗体重格式化与表达
将筛选出的VHH序列转化为可溶性重链抗体。
将VHH序列重格式化为VHH-Fc融合蛋白（IgG1骨架），在Expi293F或ExpiCHO细胞中瞬时转染表达，通过MabSelect纯化，并通过SEC检测纯度和聚集情况。
生化结合特性分析
测定抗体对EGFR的亲和力、动力学和特异性。
通过BLI进行亲和力测定（KD、kon、koff），竞争实验确定表位分箱，并检测对HER2、HER3、HER4及鼠/猴EGFR的交叉反应性。
荧光偏振（FP）研究
评估抗体对EGFR:EGF复合物平衡的影响。
将Atto-488标记的EGF与EGFR孵育至平衡，加入不同浓度抗体，监测FP值变化以判断正性或负性变构调节。
细胞结合与配体竞争实验
验证抗体在细胞水平上的结合能力及对EGF结合的影响。
利用MDA-MB-468细胞测定抗体结合（EC50），并通过生物素化EGF检测抗体对EGF结合的抑制（IC50）。
信号通路抑制实验
评估抗体对EGF诱导的MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通路的抑制作用。
使用报告基因细胞系检测MAPK/ERK通路抑制（IC50），通过HTRF检测AKT磷酸化水平，比较抗体与西妥昔单抗、matuzumab的抑制效力。
结构域映射
确定抗体在EGFR ECD上的结合结构域。
通过酵母表面展示EGFR ECD的六个截短片段，检测抗体结合以定位结合域。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
结合与亲和力分析
信号通路分析
结构表征
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抗体表达与纯化 | Expi293F细胞 | -- | -- |
| ExpiCHO细胞 | -- | -- | |
| MabSelect抗体纯化层析树脂 | GE Healthcare | -- | |
| ZymoPURE II质粒小提试剂盒 | Zymo Research | -- | |
| QIA专家系统 | Qiagen | -- | |
| 结合分析 | Octet RED®系统 | Sartorius | -- |
| AHC生物传感器 | Sartorius | -- | |
| HIS1K生物传感器 | Sartorius | -- | |
| 重组人EGFR胞外域 | Merck Healthcare KGaA | -- | |
| EGF Fc融合蛋白 | Sino Biological | 10605-H01H | |
| SureLight® APC抗6X His标签抗体 | Abcam | ab72579 | |
| R-藻红蛋白亲和纯化山羊抗人IgG，Fc片段特异性 | Jackson ImmunoResearch | 109-117-008 | |
| 抗HA标签Alexa Fluor® 488偶联抗体 | R&D Systems | IC6875G | |
| 细胞实验 | MDA-MB-468细胞系 | ATCC | -- |
| iQue3设备 | Sartorius | -- | |
| Alexa Fluor® 488抗人Fc | Jackson ImmunoResearch | 109-547-008 | |
| 碘化丙啶 | Invitrogen | -- | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-生物素 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 链霉亲和素AlexaFluor® 647偶联物 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| FP实验 | Atto 488蛋白标记试剂盒 | Sigma Aldrich | -- |
| Amicon 10K超滤管 | Sigma Aldrich | -- | |
| PHERAstar设备 | BMG | -- | |
| 信号通路 | SRE报告基因HEK293细胞系 | BPS Bioscience | -- |
| Synergy 4设备 | Biotek | -- | |
| Phospho-AKT1/2/3 (Ser473) HTRF试剂盒 | Revvity | 64AKSPEG | |
| 结构域映射 | 抗c-myc AlexaFluor® 647偶联抗体 | Abcam | ab223895 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 免疫与文库构建 | 免疫原（rhEGFR ECD 25-618）、动物种类（羊驼）和数量（2只） 阅读提示：Methods: Immunization of camelids and Library construction |
| FACS筛选 | EGFR与EGF Fc的预孵育比例（3:1）和时间（1.5小时），第一轮分选细胞数量（5×10^8） 阅读提示：Methods: Library sorting, Figure 1b |
| 抗体重格式化与表达 | 表达宿主（Expi293F/ExpiCHO）和表达时间（6/7天），纯化方法（MabSelect） 阅读提示：Methods: Expression and purification |
| BLI结合分析 | 抗体加载浓度（5 µg/mL）、EGFR浓度范围（50 nM起2倍稀释）、动力学测定时长 阅读提示：Methods: Octet assays |
| FP实验 | EGF-Atto 488浓度（100 nM）、EGFR浓度（400 nM）、抗体浓度范围（10 µM起2倍稀释） 阅读提示：Methods: Fluorescence polarization, Figure 2 legend |
| 细胞结合实验 | MDA-MB-468细胞数量（10^5每孔）、抗体浓度范围（250 nM至0.0596 pM）、bEGF浓度（100 nM） 阅读提示：Methods: Functional assays, Figure 3 legend |
| 信号通路抑制 | EGF刺激浓度（EC80，1.31 ng/mL）、抗体处理时间（24小时）、AKT实验中EGF刺激浓度（20 ng/mL）和处理时间（10分钟） 阅读提示：Methods: MAPK/ERK signaling pathway and pAKT signaling pathway, Figure 4 legend |
| 结构域映射 | EGFR ECD片段的具体残基范围（1-124, 1-176, 1-294, 273-621, 294-543, 475-621） 阅读提示：Methods: Domain mapping via YSD |