重组蛋白表达与纯化
获取用于生化与结构研究的αVβ5、Hsp90α、鸢尾素等重组蛋白。
在哺乳动物细胞和细菌系统中表达重组αVβ5胞外域、Hsp90α、鸢尾素（哺乳动物和细菌来源）等，并经亲和层析、离子交换、凝胶过滤等步骤纯化。
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鸢尾素通过整合素受体，在涉及细胞外Hsp90α的两步过程中发挥作用
Irisin acts through its integrin receptor in a two-step process involving extracellular Hsp90α.
实验完整度
高包含生化结合实验、细胞功能实验、体内实验、冷冻电镜和HDX-MS等多层级验证，并构建了经验证的分子模型。
主要模型
HEK293T细胞 SK-Mel2黑色素瘤细胞 小鼠C57BL/6J
重点核对
重组人αVβ5胞外域蛋白（αV 32-991，β5 24-717） 重组人Hsp90α（野生型及G95D突变体） 重组鸢尾素（哺乳动物细胞表达，单体） 急性运动方案（小鼠跑台运动） 整合素信号检测（pFAK Y397）
摘要
运动对人体有多种益处。鸢尾素由肌肉分泌，随运动增加，并传递生理益处，包括改善认知和抵抗神经退行性变。鸢尾素通过αV整合素发挥作用；然而，关于像鸢尾素这样的小多肽如何通过整合素进行信号传导的机制理解仍很欠缺。利用质谱和冷冻电镜，我们证明细胞外热休克蛋白90α（eHsp90α）随运动由肌肉分泌，并激活整合素αVβ5。这使得鸢尾素能够高亲和力结合并通过Hsp90α/αV/β5复合物进行信号传导。结合氢/氘交换数据，我们生成并通过实验验证了一个RMSD为2.98 Å的鸢尾素/αVβ5复合物对接模型。鸢尾素与αVβ5上的一个替代界面非常紧密地结合，该界面不同于已知配体所使用的界面。这些数据阐明了一种非经典机制，即像鸢尾素这样的小多肽激素可以通过整合素受体发挥功能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 鸢尾素作为一个小分子多肽激素，如何能够通过整合素受体（尤其是αVβ5）进行高亲和力结合和信号传导？
- 核心机制
- 运动诱导的细胞外Hsp90α（eHsp90α）直接结合并激活整合素αVβ5，使其转变为开放构象，从而允许鸢尾素以高亲和力（Kdapp约30 nM）结合于αVβ5上的一个非常规界面（区别于RGD结合位点），并通过该复合物激活下游信号（如FAK磷酸化）。
- 主要证据
- 生化结合实验（BLI、荧光各向异性）、冷冻电镜构象分析、氢/氘交换质谱（HDX-MS）结合分子对接模型、细胞实验（HEK293T、SK-Mel2）及小鼠体内实验（脂肪垫注射鸢尾素）均支持该机制。
- 研究意义
- 这些发现揭示了一种非经典的小分子激素-整合素相互作用机制，为理解鸢尾素的生理功能以及开发基于鸢尾素的疗法提供了结构基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鸢尾素与αVβ5结合特性分析
确定鸢尾素与αVβ5的结合亲和力及Hsp90α对结合的影响。
使用生物层干涉（BLI）、荧光偏振等生化方法测定鸢尾素与αVβ5（有无Hsp90α）的结合常数，并进行竞争实验。
细胞实验验证
在细胞水平验证Hsp90α对鸢尾素结合和信号传导的促进作用。
在HEK293T细胞中过表达αVβ5，检测A488-鸢尾素结合和FAK磷酸化；在SK-Mel2黑色素瘤细胞中通过抗体阻断Hsp90α，检测鸢尾素结合和细胞活力。
体内实验评估
在体内验证eHsp90α对鸢尾素介导整合素信号的作用。
给小鼠皮下注射抗Hsp90α抗体或对照IgG，然后向腹股沟脂肪垫注射重组鸢尾素，检测整合素信号（pFAK、pCREB、pSrc）和产热基因表达（UCP1、Cidea、Dio2）。
冷冻电镜构象分析
研究Hsp90α对αVβ5构象状态的影响。
通过冷冻电镜分析αVβ5和αVβ5/Hsp90α复合物中αVβ5的构象分布（闭合、延伸闭合、开放）。
HDX-MS分析鸢尾素结合界面
鉴定鸢尾素结合αVβ5后产生保护的区域，确定结合位点。
采用氢/氘交换质谱（HDX-MS）比较鸢尾素/αVβ5复合物和单独αVβ5的氘摄取差异，绘制保护图谱。
分子对接模型构建与验证
生成鸢尾素/αVβ5复合物的原子模型，并通过实验验证模型预测。
使用MD模拟和HADDOCK对接，基于HDX-MS和化学计量结果生成模型；通过荧光偏振竞争实验和突变体分析进行验证。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 重组蛋白表达 | Expi293F细胞 | Life Technologies | A14527 |
| Expi293F表达培养基 | Life Technologies | A1435101 | |
| 25 kDa线性聚乙烯亚胺 | -- | -- | |
| T7-Express感受态大肠杆菌 | New England BioLabs | C2566 | |
| 蛋白纯化 | Ni Sepharose excel 组氨酸标签蛋白纯化树脂 | Cytiva | 17371201 |
| Strep-Tactin Superflow 高容量树脂 | IBA | 2-1208 | |
| Mono Q 10/100 GL 离子交换柱 | Cytiva | 17516701 | |
| Superdex 200 10/300 GL 凝胶过滤柱 | Cytiva | 17517501 | |
| Ni-NTA Superflow 琼脂糖 | Thermo Fisher Scientific | 25214 | |
| Pierce 谷胱甘肽琼脂糖 | Thermo Scientific | 16100 | |
| TALON 金属亲和树脂 | Takara | 635503 | |
| 生化结合实验 | 链霉亲和素生物传感器 | ForteBio | 18-5019 |
| 细胞实验 | FreeStyle293表达培养基 | Life Technologies | 12338018 |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | 11668500 |
| 蛋白裂解 | RIPA裂解缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | 89901 |
| Complete, Mini, EDTA-free 蛋白酶抑制剂 | Roche | 11873580001 | |
| PhosSTOP磷酸酶抑制剂 | Roche Diagnostics | 049068450001 | |
| Pierce 通用核酸酶 | Thermo Fisher Scientific | 88700 | |
| 免疫沉淀 | Pierce 蛋白A琼脂糖 | Thermo Fisher Scientific | 20333 |
| Western blot | 抗Hsp90α抗体 | Invitrogen | PA3-013 |
| 抗磷酸化FAK (Tyr397)抗体 | Cell Signaling Technology | 3283S | |
| 抗FAK抗体 | Cell Signaling Technology | 3285S | |
| 抗磷酸化CREB (Ser133)抗体 | Cell Signaling Technology | 9198S | |
| 抗CREB抗体 | Cell Signaling Technology | 9104S | |
| 抗整合素αV抗体 | Cell Signaling Technology | 60896S | |
| 抗整合素β5抗体 | Abcam | ab184312 | |
| 抗6xHis标签抗体 | Abcam | ab9108 | |
| 抗Src抗体 | Cell Signaling Technology | 2108S | |
| 抗磷酸化Src (Tyr416)抗体 | Cell Signaling Technology | 6943S | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 647标记山羊抗小鼠IgG二抗 | Invitrogen | A21235 |
| DAPI | Calbiochem | 268298 | |
| 细胞培养 | HEK293T细胞 | ATCC | CRL-3216 |
| SK-Mel-2细胞 | ATCC | HTB-68 | |
| 动物实验 | C57BL/6J小鼠 | The Jackson Laboratory | 000664 |
| 分子克隆 | FX克隆系统试剂盒 | Addgene | 1000000039 |
| 蛋白表达 | ExpiFectamine 293转染试剂盒 | Life Technologies | A14524 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | 74104 | |
| 无RNase的DNase试剂盒 | Qiagen | 79254 | |
| RT-qPCR | 高容量cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | 4368814 |
| GoTaq qPCR和RT-qPCR系统 | Promega | A6002 | |
| 蛋白定量 | Pierce去污剂兼容型Bradford蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | 23246 |
| 质谱检测 | TMTpro 16plex标记试剂盒 | Thermo Fisher | A44522 |
| Orbitrap Fusion Lumos质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Proxeon EASY-nLC 1200液相色谱泵 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Accucore C18树脂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| HDX-MS | Waters Synapt G2-Si HDMSE质谱仪 | Waters | -- |
| ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱 | Waters | 186003535 | |
| 冷冻电镜 | Titan Krios冷冻电镜 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| K3直接电子探测器 | Gatan | -- | |
| C-flat多孔碳支持膜 | Electron Microscopy Sciences | 71150 | |
| 负染色电镜 | Tecnai T12透射电子显微镜 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| SEC-MALS | DAWN-HELEOS多角度光散射检测器 | Wyatt Technology | -- |
| Optilab DSP干涉折光仪 | Wyatt Technology | -- | |
| 细胞活力测定 | Clariostar酶标仪 | BMG Labtech | -- |
| MST | Monolith NT.115pico微量热泳动仪 | NanoTemper Technologies | -- |
| 标准处理毛细管 | NanoTemper Technologies | K002 | |
| 去糖基化 | 蛋白去糖基化混合试剂II | New England Biolabs | P6044S |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 重组蛋白制备 | αVβ5胞外域构建：αV（32-991）和β5（24-717），C端带有HRV3C位点和标签；Hsp90α全长；鸢尾素哺乳动物表达（单体）或细菌表达（二聚体） 阅读提示：Methods - Plasmids, Recombinant protein expression and purification |
| 生化结合实验 | 缓冲液（10 mM Hepes pH7.4, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2或1 mM MnCl2）；蛋白浓度 阅读提示：Figure 1B, 1D, 1G, 1H; Methods - Protein binding assays |
| 细胞实验 | HEK293T转染质粒（αV, β5全长）；Hsp90α预处理浓度1 nM；鸢尾素浓度0.1 nM或1 nM；处理时间5分钟 阅读提示：Figure 3B; Methods - Detection of integrin signaling in HEK293T cells |
| 体内实验 | 小鼠品系C57BL/6J，8周龄雄性；抗Hsp90α抗体剂量500 μg/kg（皮下）；鸢尾素剂量5 mg/kg（脂肪垫注射） 阅读提示：Figure 3J; Methods - Detection of integrin signaling in iWAT |
| 冷冻电镜构象分析 | 样品浓度0.5-0.8 mg/mL；网格类型C-flat holey carbon grids；如无实验条件，注意构象比例受Hsp90α影响 阅读提示：Methods - Cryo-EM and Image Processing |
| HDX-MS | 鸢尾素和αVβ5浓度（20 μM与4 μM）；缓冲液（10 mM Hepes pH7.4, 150 mM NaCl, 1 mM MnCl2）；标记时间10秒、10分钟、4小时 阅读提示：Methods - Hydrogen/Deuterium exchange (HDX) mass spectrometry |