验证肥胖对CD4+ T细胞活化增殖的影响
比较肥胖与瘦小鼠CD4+ T细胞在TCR刺激下的活化与增殖能力。
从HFD或自然衰老肥胖小鼠分离CD4+ T细胞，用TCR刺激，检测增殖和Il2/Ifng表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
Goliath通过连接脂肪酸β氧化与糖酵解诱导肥胖小鼠炎症
Goliath induces inflammation in obese mice by linking fatty acid β-oxidation to glycolysis.
实验完整度
高包含细胞实验、动物模型及患者样本，涵盖体外功能验证（增殖、糖酵解）、机制验证（蛋白互作、泛素化）和体内炎症模型验证。
主要模型
CD4+ T细胞 高脂饮食诱导的肥胖小鼠 BM12/SJL小鼠炎症模型
重点核对
CD4+ T细胞分离自脾脏和淋巴结，采用CD4+CD44loCD62Lhi分选 高脂饮食（HFD，60 kcal%脂肪）喂养6-8周龄小鼠长达4个月 TCR刺激使用α-CD3/CD28（1/1 μg/ml） 2-DG浓度5 mM，D-半乳糖20 mM 体内实验中，2-DG剂量200 mg/kg，DC-Gonib32剂量50 mg/kg
摘要
肥胖与代谢紊乱和慢性炎症相关。然而，肥胖相关的代谢对炎症诱导的贡献仍不清楚。在此，我们表明，与瘦小鼠相比，肥胖小鼠的CD4+ T细胞表现出基础水平的脂肪酸β氧化（FAO）升高，这会促进T细胞糖酵解并因此导致过度激活，从而增强炎症诱导。机制上，FAO限速酶肉碱棕榈酰转移酶1a（Cpt1a）稳定线粒体E3泛素连接酶Goliath，后者介导钙调磷酸酶的去泛素化，从而增强NF-AT信号通路的激活，进而促进肥胖中CD4+ T细胞的糖酵解和过度激活。我们还报道了特异性GOLIATH抑制剂DC-Gonib32，它能阻断肥胖小鼠CD4+ T细胞中的FAO-糖酵解代谢轴并减少炎症诱导。总的来说，这些发现确立了Goliath桥接的FAO-糖酵解轴在介导肥胖小鼠CD4+ T细胞过度激活和炎症中的作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肥胖如何通过代谢重编程促进CD4+ T细胞过度激活及炎症诱导？
- 核心机制
- 肥胖升高的FAO通过Cpt1a稳定Goliath蛋白，激活Usp9x，介导钙调磷酸酶去泛素化，增强NF-AT信号，促进糖酵解和CD4+ T细胞过度激活。
- 主要证据
- 通过RNA-seq、OCR和ECAR检测证实肥胖CD4+ T细胞FAO和糖酵解增强；Cpt1a或Goliath敲除小鼠及特异性抑制剂DC-Gonib32处理可逆转该现象；BM12/SJL转移模型确认其对炎症的促进。
- 研究意义
- 定义FAO-糖酵解轴在肥胖相关炎症中的作用，并提示Goliath抑制剂DC-Gonib32可能用于治疗肥胖/衰老相关炎症性疾病。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估肥胖CD4+ T细胞的糖酵解代谢
确定肥胖是否特异性增强CD4+ T细胞的糖酵解代谢。
用ECAR、代谢流及糖酵解相关基因表达检测TCR刺激后的CD4+ T细胞。
检测基础FAO对糖酵解的促进作用
验证肥胖升高的FAO促进CD4+ T细胞糖酵解的因果关系。
用PPARα激动剂非诺贝特或Cpt1a抑制剂依托莫司处理CD4+ T细胞，检测糖酵解和增殖。
鉴定Goliath介导的钙调磷酸酶去泛素化
阐明FAO调控糖酵解的分子机制。
通过免疫印迹、Co-IP、质谱和敲除小鼠验证Goliath-Usp9x-CaN通路。
评估Goliath在肥胖相关炎症中的功能
确定Goliath对肥胖增强的体内炎症的作用。
将WT或Goliath-KO CD4+ T细胞转移至BM12/SJL小鼠，检测抗体产生和IgG沉积。
筛选并验证Goliath抑制剂DC-Gonib32
寻找阻断FAO-糖酵解轴的化学工具。
使用TransformerCPI筛选化合物库，体外验证DC-Gonib32的功能，并在体内评价其效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Sigma-Aldrich | D5030 |
| RPMI 1640培养基 | Hyclone | SH30809.01 | |
| 胎牛血清 | Biological Industries | 04-001-1A | |
| 药物处理 | 依托莫司 | Sigma-Aldrich | E1905 |
| 非诺贝特 | Sigma-Aldrich | F6020 | |
| 2-脱氧-D-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | D8375 | |
| D-半乳糖 | Sigma-Aldrich | G0750 | |
| 环孢素A | Sigma-Aldrich | 239835 | |
| 他克莫司 | SelleckChem | S5003 | |
| 细胞培养 | MG132 | Sigma-Aldrich | G2211 |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| 细胞刺激 | 佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯 | Sigma-Aldrich | P1585 |
| 离子霉素 | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| 抗CD3抗体 | BioXcell | BE0001-1 | |
| 抗CD28抗体 | BioXcell | BE0015-1 | |
| Western blot | Immobilon Western化学发光HRP底物 | Epizyme | SQ201 |
| 蛋白质检测 | BODIPY荧光染料 | GLPBIO | GC42959 |
| 代谢分析 | Seahorse XF糖酵解压力测试试剂盒 | Agilent | 103020-100 |
| Seahorse XF细胞线粒体压力测试试剂盒 | Agilent | 103015-100 | |
| GC-MS | 岛津QP-2010 Ultra气相色谱-质谱联用仪 | Shimadzu | -- |
| 流式分析 | Gallios流式细胞仪 | Beckman | -- |
| 显微镜 | LSM880共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | -- |
| ELISA | Hep-2 ANA检测试剂盒 | INOVA Diagnostics | 708100 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596018 |
| RT-qPCR | PrimeScript RT试剂盒 | Takara | RR037A |
| 蛋白质纯化 | Ni2+-Sepharose 6 Fast Flow树脂 | GE Healthcare | -- |
| Superdex S200色谱柱 | GE Healthcare | -- | |
| 药物筛选 | TransformerCPI | -- | -- |
| 分子克隆 | Lipofilter™转染试剂 | Hanbio | HB-LF10001 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型 | HFD (60 kcal%脂肪)喂养起始周龄（6-8周）及持续时间（最长4个月）；自然衰老模型（17个月） 阅读提示：Materials and Methods - Mice and human samples |
| CD4+ T细胞分离与活化 | 分离自脾脏和淋巴结，CD4+CD44loCD62Lhi分选；TCR刺激浓度（α-CD3/CD28 1/1 μg/ml）及时间 阅读提示：Materials and Methods - T cell activation and proliferation |
| 代谢检测 | ECAR和OCR检测条件：细胞密度（2×10^5细胞/孔），葡萄糖(25 mM)、寡霉素(5 μM)、2-DG(100 mM)的浓度；FAO检测使用FAO缓冲液及棕榈酸-BSA 阅读提示：Materials and Methods - Extracellular flux analysis |
| 体内炎症模型 | CD4+ T细胞转移数量（7.5×10^6）；2-DG (200 mg/kg)或DC-Gonib32 (50 mg/kg)给药频率及持续时间（每天一次，共3周） 阅读提示：Materials and Methods - Induction of in vivo inflammation and antibody detection |
| 抑制剂筛选 | TransformerCPI模型参数：学习率1e-5，权重衰减1e-3，批量大小8，梯度累积至64；化合物库筛选策略 阅读提示：Materials and Methods - Screening of small-molecule inhibitors of Goliath |