检测FGF18在肝脏IRI中的表达和来源
明确FGF18在肝脏IRI中的表达变化和主要分泌细胞。
通过公开RNA-seq、临床样本分析、小鼠IRI模型、免疫荧光和原代细胞分离，检测FGF18表达及细胞定位。
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FGF18通过USP16介导的KEAP1/Nrf2信号通路减轻雄性小鼠肝脏缺血再灌注损伤
FGF18 alleviates hepatic ischemia-reperfusion injury via the USP16-mediated KEAP1/Nrf2 signaling pathway in male mice.
实验完整度
高研究包含体外细胞实验、HSC特异性敲除小鼠、FGF18过表达小鼠、Nrf2敲除小鼠和临床患者样本，并进行了功能验证与机制验证（如Co-IP、CHIP、泛素化检测）。
主要模型
雄性C57BL/6小鼠肝脏IRI模型 Fgf18△HSC小鼠（HSC特异性FGF18敲除） FGF18过表达小鼠（AAV2/9-FGF18） L02、HepG2、HEK293T细胞 肝星状细胞（HSCs）
重点核对
1. 雄性C57BL/6小鼠（8-12周龄）构建70%肝脏IRI模型 2. FGF18敲除或过表达效率验证 3. FGF18处理剂量：10、20 μg/kg，腹腔注射 4. 细胞系L02、HepG2、HEK293T的H/R模型条件 5. 样本量n=3或n=5，重复次数明确
摘要
肝脏缺血再灌注损伤（IRI）是肝切除和移植过程中常见的并发症。然而，肝脏IRI的潜在机制尚未完全阐明。在此，我们旨在探讨成纤维细胞生长因子18（FGF18）在肝脏IRI中的作用。本研究发现，肝星状细胞（HSCs）分泌FGF18并减轻肝细胞损伤。HSCs特异性敲除FGF18显著加重肝脏IRI。机制上，FGF18处理降低泛素羧基末端水解酶16（USP16）的水平，导致Kelch样ECH相关蛋白1（KEAP1）的泛素化水平升高，并激活核因子E2相关因子2（Nrf2）。此外，USP16与KEAP1相互作用并去泛素化KEAP1。更重要的是，Nrf2直接结合USP16的启动子，并与USP16形成负反馈环。总之，我们的结果表明FGF18通过USP16/KEAP1/Nrf2信号通路减轻雄性小鼠的肝脏IRI，提示FGF18是肝脏IRI的一种有前景的治疗方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探究FGF18在肝脏缺血再灌注损伤中的作用及其分子机制。
- 核心机制
- FGF18通过下调USP16表达，减少KEAP1的K48连接泛素化降解，从而激活Nrf2信号通路；Nrf2反馈抑制USP16转录，形成负反馈环路。
- 主要证据
- 使用FGF18过表达和HSC特异性敲除小鼠模型，以及体外H/R细胞实验，通过Western blot、Co-IP、CHIP、泛素化检测和TUNEL等技术验证了FGF18的保肝作用及USP16/KEAP1/Nrf2机制。
- 研究意义
- 作者提出FGF18作为治疗肝脏缺血再灌注损伤的潜在靶点，为临床干预提供了新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证FGF18过表达对肝脏IRI的保护作用
评估FGF18过表达是否能减轻肝脏IRI损伤。
通过尾静脉注射AAV2/9-FGF18构建过表达小鼠，检测血清ALT/AST、肝组织坏死、肝细胞凋亡和炎症指标。
HSC特异性敲除FGF18对肝脏IRI的影响
验证HSCs来源的FGF18在肝脏IRI中的必要作用。
通过GFAP-Cre与Fgf18f/f杂交构建Fgf18△HSC小鼠，检测敲除后IRI损伤加重情况。
确定USP16在FGF18保护作用中的依赖性
验证FGF18的保护作用是否依赖于USP16。
构建Usp16△Hep小鼠，通过AAV-TBG-Cre敲除肝细胞USP16，联合FGF18过表达，观察IRI损伤变化。
验证Nrf2在FGF18保护作用中的依赖性
验证Nrf2是否介导FGF18的保护作用。
使用Nrf2 KO小鼠，注射AAV-FGF18后行IRI手术，检测损伤指标和组织学变化。
机制验证：USP16与KEAP1相互作用及去泛素化
验证USP16是否直接与KEAP1结合并通过去泛素化稳定KEAP1。
通过Co-IP、质谱、免疫荧光、PLA、GST-pull-down实验验证相互作用，并检测USP16敲低或过表达对KEAP1泛素化水平的影响。
验证Nrf2对USP16的转录调控及反馈回路
验证Nrf2是否直接结合USP16启动子并形成负反馈回路。
使用CHIP、荧光素酶报告基因实验，检测Nrf2对USP16启动子的结合及转录调控。
外源性FGF18治疗对肝脏IRI的影响
评估外源性FGF18蛋白对肝脏IRI的治疗潜力。
腹腔注射重组FGF18蛋白，检测肝功能、组织学、凋亡和炎症指标。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 1640培养基 | Procell | -- |
| MEM培养基 | Procell | PM150410P | |
| DMEM培养基 | Gibco | 11966025 | |
| 细胞分离 | IV型胶原酶 | Sigma | -- |
| NycodenZ | Accurate Chemical | 1002424 | |
| 超纯磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-092-007 | |
| 药物处理 | LY294002 | Selleck Chemicals | 154447-36-6 |
| ML385 | Selleck Chemicals | 846557-71-9 | |
| MG132 | Selleck Chemicals | 1211877-36-9 | |
| 氯喹 | Selleck Chemicals | 54-05-7 | |
| 人FGF18 | Wenzhou Medical University Gene Engineering Laboratory | -- | |
| 小鼠FGF18 | Sino Biological | 50177-M08H | |
| 细胞培养 | Percoll | -- | -- |
| 蛋白检测 | Pierce BCA蛋白测定试剂 | Thermo Fisher Scientific | 23228 |
| Western blot | PVDF膜 | Merck Millipore | IPVH00010 |
| ELISA | 人FGF18 ELISA试剂盒 | CUSABIO | K05010174 |
| 小鼠FGF18 ELISA试剂盒 | JINGMEI BIOTECHNOLOGY | JM-12187M1 | |
| IRI模型 | AAV2/9-FGF18 | -- | -- |
| AAV-TBG-Cre | -- | -- | |
| 染色 | DHE | Beyotime | S0063 |
| DCFH-DA | Beyotime | S0033S | |
| 凋亡检测 | 原位凋亡检测试剂盒 | Roche Molecular Biochemicals | -- |
| 蛋白相互作用 | Protein A/G磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 质谱 | LTQ Velos Pro质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNA-seq | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| VAHTS链特异性mRNA-seq文库制备试剂盒 | Vazyme Biotech | NR612-02 | |
| RT-PCR | HiScript III逆转录试剂盒 | Vazyme | -- |
| 转染 | Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNA干扰 | si-FGFR3 | Santa Cruz | sc-29314 |
| si-NRF2 | Santa Cruz | sc-37030 | |
| si-scramble | Santa Cruz | sc-37007 | |
| si-FGF18 | Santa Cruz | sc-39478 | |
| si-USP16 | Limibio Co., Ltd | -- | |
| 蛋白提取 | IP缓冲液 | Beyotime | P10013J |
| 蛋白纯化 | GST琼脂糖珠 | Beyotime | P2138 |
| Flag-USP16纯化试剂盒 | Beyotime | P9801 | |
| 蛋白检测 | 银染试剂盒 | Beyotime | P0017S |
| CHIP | CHIP检测试剂盒 | Beyotime | P2083S |
| 细胞培养 | Transwell小室 | Corning | -- |
| 组织染色 | DAB免疫组化试剂盒 | -- | -- |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 647山羊抗小鼠IgG | Abcam | ab150119 |
| Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG | Abcam | ab150077 | |
| PLA | PLA试剂盒 | Merck | DUO92102-1KT |
| 蛋白检测 | FGF18抗体 | Santa Cruz | sc-393471 |
| FGFR1抗体 | CST | 9740S | |
| FGFR2抗体 | CST | 23328S | |
| FGFR3抗体 | CST | 4574S | |
| FGFR4抗体 | CST | 8562S | |
| BCL-2抗体 | Huabio | ET1702-53 | |
| BAX抗体 | CST | 2772S | |
| c-Cas-3抗体 | CST | 9661S | |
| Nrf2抗体 | Proteintech | 16396-1-AP | |
| HO-1抗体 | Proteintech | 10701-1-AP | |
| KEAP1抗体 | Proteintech | 10503-2-AP | |
| USP16抗体 | Proteintech | 14055-1-AP | |
| HA抗体 | Proteintech | 51064-2-AP | |
| Flag抗体 | Proteintech | 66008-4-Ig | |
| His抗体 | Santa Cruz | sc-8036 | |
| 泛素抗体 | Santa Cruz | sc-8017 | |
| H2A抗体 | Abclonal | A3692 | |
| GST抗体 | Huabio | ET1611-47 | |
| GAPDH抗体 | Santa Cruz | sc-393471 | |
| 免疫沉淀 | Anti-Flag抗体（用于IP） | CST | 3900 |
| Protein A/G磁珠 | Meck | LSKMAGAG10 | |
| 肝脏损伤检测 | ALT/AST试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- |
| 氧化应激检测 | MDA/GSH检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- |
| 统计学 | GraphPad Prism 5.0 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 雄性C57BL/6小鼠，70%肝脏IRI模型，缺血1h/再灌注6h；FGF18过表达使用AAV2/9-FGF18（1x10^11病毒颗粒/200μL PBS）尾静脉注射；HSC特异性敲除使用GFAP-Cre;Fgf18f/f；Nrf2 KO小鼠；Usp16f/f小鼠+AAV-TBG-Cre 阅读提示：Methods: Animals, Mouse liver I/R injury model |
| 细胞培养 | L02、HepG2、HEK293T细胞；H/R模型：L02和HepG2缺氧4h/复氧6h，HepG2缺氧5h/复氧2h；LX-2细胞缺氧4h/复氧6h 阅读提示：Methods: Cell culture and hypoxia/reoxygenation (H/R) model |
| 药物处理 | FGF18重组蛋白10、20μg/kg腹腔注射；MG132（10μM）；CQ（50μM）；ML385（10μM） 阅读提示：Methods: Reagents, Mouse liver I/R injury model, Fig 5A, Fig 8A |
| 分子机制验证 | Co-IP使用IP buffer，抗体量1μg，Protein A/G磁珠；泛素化检测需1% SDS裂解；CHIP使用Beyotime试剂盒；荧光素酶报告基因使用pGL3载体 阅读提示：Methods: Co-immunoprecipitation and ubiquitination assays, Chromatin immunoprecipitation, Luciferase assays |
| 统计设计 | 数据以mean±SEM表示；两两比较用双尾学生t检验，多组比较用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey多重比较，P<0.05为显著性 阅读提示：Methods: Statistical analysis |