小鼠肿瘤模型建立及疫苗接种
建立肿瘤负担下COVID-19疫苗反应减弱的模型，并评估PD-1/PD-L1阻断的影响。
C57BL/6小鼠皮下接种MC38或B16F10肿瘤细胞，然后进行SARS-CoV-2 RBD蛋白疫苗（原型和Omicron）的初免-加强免疫，并给予抗PD-L1抗体或对照处理。
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PD-1/PD-L1阻断恢复肿瘤诱导的COVID-19疫苗反应减弱
PD-1/PD-L1 blockade restores tumor-induced COVID-19 vaccine bluntness.
实验完整度
高包含多种小鼠肿瘤模型（MC38、B16F10）、疫苗接种、ELISA、假病毒中和、流式细胞术及过继转移实验，进行功能验证和机制验证。
主要模型
MC38结肠腺癌小鼠模型 B16F10黑色素瘤小鼠模型 SM转基因T细胞过继转移模型
重点核对
使用C57BL/6小鼠，皮下接种2×10^5 MC38或B16F10细胞 接种疫苗：第3天和第13天分别免疫SARS-CoV-2原型RBD和Omicron RBD（各5 μg）加CpG ODN 1826（10 μg） 抗PD-L1抗体（克隆10F.9G2）200 μg腹腔注射，从第6天至第21天每3天一次，共6次 ELISA检测血清IgG抗体滴度，假病毒中和实验测定NT50 流式细胞术分析疫苗引流淋巴结中B细胞、GC B细胞、TFH细胞和TFR细胞
摘要
COVID-19疫苗接种对于抵御全球大流行至关重要。然而，越来越多的研究揭示癌症患者的COVID-19疫苗有效性严重减弱。PD-1/PD-L1免疫检查点阻断（ICB）疗法在部分癌症患者中产生持久治疗反应，并已在临床上获批用于治疗多种癌症。因此，探索PD-1/PD-L1 ICB疗法在恶性肿瘤持续存在时对COVID-19疫苗有效性的潜在影响至关重要。在本研究中，利用临床前模型，我们发现肿瘤抑制的COVID-19疫苗反应在PD-1/PD-L1 ICB治疗背景下大部分被恢复。我们还发现，PD-1/PD-L1阻断介导的COVID-19疫苗有效性恢复与抗肿瘤治疗结局无关。机制上，恢复的COVID-19疫苗有效性与PD-1/PD-L1阻断驱动的滤泡辅助性T细胞和生发中心反应在恶性肿瘤持续存在时的优势相关。因此，我们的发现表明，PD-1/PD-L1阻断将极大地使癌症患者对COVID-19疫苗接种的反应正常化，而不论其对这些患者的抗肿瘤疗效如何。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PD-1/PD-L1免疫检查点阻断疗法对癌症患者COVID-19疫苗有效性的影响及其机制是什么？
- 核心机制
- PD-1/PD-L1阻断通过增强滤泡辅助性T细胞（TFH）和生发中心（GC）反应，恢复肿瘤抑制的COVID-19疫苗抗体反应，且不依赖于抗肿瘤疗效。
- 主要证据
- 在MC38和B16F10肿瘤小鼠模型中，抗PD-L1治疗恢复了肿瘤抑制的SARS-CoV-2 RBD特异性抗体反应和中和活性，并伴随疫苗引流淋巴结中B细胞、GC B细胞和TFH细胞数量及频率的增加。
- 研究意义
- 研究表明PD-1/PD-L1阻断联合COVID-19疫苗可能改善癌症患者对SARS-CoV-2感染的保护，即使PD-1/PD-L1治疗未能控制肿瘤进展。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
抗体反应评估
检测疫苗诱导的SARS-CoV-2 RBD特异性IgG抗体和中和抗体水平。
在初免和加强免疫后第10天采集血清，通过ELISA检测RBD特异性IgG抗体，并通过假病毒中和实验测定中和抗体滴度。
B细胞和TFH细胞反应分析
探讨肿瘤负担和PD-L1阻断对疫苗引流淋巴结中B细胞和TFH细胞反应的影响。
在第23天（肿瘤接种后）收集疫苗引流淋巴结，通过流式细胞术分析B细胞、GC B细胞、TFH细胞和TFR细胞的频率和数量。
抗原特异性GC TFH细胞追踪
验证肿瘤负担和PD-L1阻断对病毒抗原特异性GC TFH细胞反应的调节。
将CD45.1+ SM细胞过继转移至MC38肿瘤小鼠，进行LCMV GP61-80肽免疫，通过流式分析供体SM细胞中的GC TFH细胞（CXCR5+PD-1hiBcl-6hi）。
ICB耐药肿瘤模型验证
评估PD-L1阻断在对抗PD-L1治疗不敏感的肿瘤模型中能否恢复COVID-19疫苗反应。
使用B16F10黑色素瘤模型，进行同样的疫苗接种和抗PD-L1处理，检测抗体和细胞反应。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | MC38细胞 | ATCC | -- |
| B16F10细胞 | ATCC | -- | |
| 动物实验 | C57BL/6小鼠 | Jackson Laboratories | -- |
| CD45.1+同源小鼠 | Jackson Laboratories | -- | |
| 疫苗接种 | SARS-CoV-2原型RBD蛋白 | Sino Biological | 40592-V08H |
| SARS-CoV-2 Omicron RBD蛋白 | Sino Biological | 40592-V08H122 | |
| CpG ODN 1826佐剂 | Invitrogen | -- | |
| LCMV GP61-80肽 | -- | -- | |
| 药物处理 | 抗PD-L1抗体 | BioXcell | 10F.9G2 |
| ELISA | ELISA板 | Thermo Fisher | 446469 |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体 | Bioss Biotech | -- | |
| TMB底物 | Beyotime | -- | |
| 假病毒中和实验 | 荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Promega | E1910 |
| 流式细胞术 | 抗小鼠CD4抗体 | Biolegend | RM4-5 |
| 抗小鼠CD45.1抗体 | Biolegend | A20 | |
| 抗小鼠PD-1抗体 | Biolegend | 29F.1A12 | |
| 抗小鼠CD44抗体 | eBioscience | IM7 | |
| 抗小鼠B220抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗小鼠CD19抗体 | Biolegend | 1D3/CD19 | |
| 抗小鼠FAS抗体 | BD Biosciences | Jo2 | |
| 花生凝集素 | Vector Labs | FL-1071 | |
| 抗小鼠Bcl-6抗体 | BD Biosciences | K112-91 | |
| 抗小鼠FoxP3抗体 | eBioscience | FJK-16s | |
| 纯化抗CXCR5抗体 | BD Biosciences | -- | |
| 生物素化抗大鼠IgG抗体 | Jackson Immunoresearch | -- | |
| 链霉亲和素 | Thermo Fisher | -- | |
| Foxp3/转录因子染色缓冲液套装 | eBioscience | 00-5523 | |
| LIVE/DEAD可固定近红外死细胞染色试剂盒 | Life Technologies | -- | |
| FACSCanto II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| FACSFortesa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 细胞培养 | DMEM-10培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | -- | |
| 统计分析 | Prism 9.0统计软件 | GraphPad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型建立 | 小鼠品系、年龄、性别；肿瘤细胞系（MC38或B16F10）及接种数量（2×10^5）；肿瘤接种部位（左大腿前外侧）；抗PD-L1抗体剂量（200 μg）及给药方案（每3天一次，共6次） 阅读提示：Methods 2.1 Mice, 2.3 Tumor models; 图1A和图5A |
| 疫苗接种 | 疫苗类型（RBD蛋白）；剂量（5 μg）；佐剂（CpG ODN 1826，10 μg）；接种途径（肌肉注射）；接种时间（第3天和第13天） 阅读提示：Methods 2.2 Immunization schedule; 图1A |
| 抗体检测 | ELISA包被抗原、血清稀释倍数、检测抗体；假病毒中和实验所用假病毒类型、血清稀释倍数、NT50计算方法 阅读提示：Methods 2.4 ELISA, 2.5 SARS-CoV-2 pseudovirus neutralization assay |
| 流式细胞术 | 流式抗体克隆及荧光标记；细胞表面和胞内染色步骤；CXCR5染色步骤；GC B细胞定义（FAS+PNA+）；TFH细胞定义（CD4+FoxP3-CXCR5+CD44hi或PD-1hi）；TFR细胞定义（CD4+FoxP3+CXCR5+） 阅读提示：Methods 2.6 Flow cytometry; 图2和图3图注 |
| 过继转移模型 | SM细胞来源及数量（2×10^5）注射时间和途径；LCMV GP61-80肽免疫剂量和时间 阅读提示：Methods 2.2 Immunization schedule; 4.2节和图4A |