鉴定HLA-I表位富集肽段
筛选SARS-CoV-2蛋白组中富含人类HLA-I表位的区域，作为T细胞疫苗的候选抗原。
使用NetMHCpan和IEDB工具预测78个常见HLA-I等位基因的表位，以IC50<10 nM为有效标准，选择表位密度最高的NSP-31443-1605、NSP-4232-444、NSP-61-201，并构建报告细胞系统验证其能激活COVID-19恢复期患者CD8+ T细胞。
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基于mRNA的T细胞诱导抗原增强COVID-19疫苗对SARS-CoV-2变异株的保护效果
An mRNA-based T-cell-inducing antigen strengthens COVID-19 vaccine against SARS-CoV-2 variants.
实验完整度
高包含体外报告细胞系统、HLA转基因小鼠、非人灵长类模型，并进行了CD8+ T细胞耗竭实验、病毒攻毒和病理学验证，功能与机制验证完整。
主要模型
人源化HLA-A*02:01/DR1转基因小鼠 人源化HLA-A*11:01/DR1转基因小鼠 雌性恒河猴（Macaca mulatta） HEK293T报告细胞
重点核对
HLA-EPs和RBDbeta的mRNA-LNP剂量（小鼠0.5或10 μg，猴100 μg） 免疫方案（两剂，间隔3周，肌肉注射） 攻毒剂量和途径（小鼠1.4×10^5 PFU B.1.351或2.0×10^5 PFU Omicron鼻内；猴7.0×10^5 PFU气管和鼻腔） CD8+ T细胞耗竭（抗CD8-α抗体100 μg/只） 病毒载量检测时间点（感染后4天或7天）
摘要
通过大规模疫苗接种实现的群体免疫是预防传染性疾病的有效方法。然而，新出现的SARS-CoV-2变异株频繁突变，在很大程度上逃避了基于Spike的COVID-19疫苗诱导的体液免疫。在此，我们开发了一种脂质纳米颗粒（LNP）配制的mRNA为基础的T细胞诱导抗原，其靶向SARS-CoV-2蛋白组中富含人类HLA-I表位的三个区域（HLA-EPs）。HLA-EPs免疫可在人源化HLA-A*02:01/DR1和HLA-A*11:01/DR1转基因小鼠中诱导强效细胞免疫反应，从而预防SARS-CoV-2感染。值得注意的是，HLA-EPs的序列在SARS-CoV-2关注变异株中高度保守。在人源化HLA转基因小鼠和雌性恒河猴中，用编码HLA-EPs和SARS-CoV-2 B.1.351变异株受体结合域（RBDbeta）的LNP配制的mRNA进行双重免疫，在预防SARS-CoV-2 Beta和Omicron BA.1变异株感染方面比单独免疫LNP-RBDbeta更有效。本研究证明了全面刺激体液和细胞免疫反应以增强疫苗效力的必要性，从而为优化COVID-19疫苗设计提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 面对SARS-CoV-2变异株的免疫逃逸，能否通过添加保守的T细胞诱导抗原增强现有RBD疫苗的保护效力？
- 核心机制
- 靶向非结构蛋白保守HLA-I表位的mRNA抗原（HLA-EPs）诱导广谱、保守的CD8+ T细胞反应，与RBD疫苗联用时，所诱导的细胞免疫在清除病毒中发挥关键作用，从而增强对变异株的保护。
- 主要证据
- 在HLA转基因小鼠和恒河猴中，LNP-HLA-EPs与LNP-RBDbeta联合免疫显著降低病毒载量和病理损伤，且该保护作用在CD8+ T细胞耗竭后基本消除；HLA-EPs序列在变异株中高度保守，免疫原性不受突变影响。
- 研究意义
- 作者提出优化COVID-19疫苗应同时包含诱导广泛CTL的保守非结构蛋白片段和诱导中和抗体的抗原，为设计下一代SARS-CoV-2疫苗提供策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
HLA-EPs mRNA疫苗的构建及免疫原性评估
评估LNP配制的HLA-EPs mRNA在HLA转基因小鼠中诱导CD8+ T细胞反应的能力。
将三个表位富集肽段串联，上游添加泛素序列，构建mRNA并包封LNP，免疫HLA-A*02:01/DR1和HLA-A*11:01/DR1转基因小鼠，检测IFN-γ ELISpot、ICS、记忆T细胞亚群及CD8+ T细胞依赖性保护。
双价疫苗（HLA-EPs+RBDbeta）的免疫应答评估
评估LNP-HLA-EPs与LNP-RBDbeta联合免疫是否增强体液和细胞免疫反应。
HLA-A*02:01/DR1转基因小鼠免疫LNP-RBDbeta、LNP-RBDbeta+LNP-HLA-EPs（各0.5 μg）或PBS，检测RBD特异性IgG、中和抗体、GC B细胞、Tfh细胞、IFN-γ和IL-4 ELISpot、ICS。
双价疫苗在HLA转基因小鼠中的攻毒保护评价
验证联合免疫对SARS-CoV-2 Beta和Omicron变异株感染的保护效果及CD8+ T细胞依赖性。
免疫小鼠在加强后21天攻毒，感染后4天检测肺和气管病毒载量及病理变化。
双价疫苗在恒河猴中的免疫原性和保护评价
在非人灵长类中验证联合免疫的免疫原性和对SARS-CoV-2感染的保护作用。
恒河猴肌肉注射两剂100 μg的LNP-RBDbeta或联合LNP-HLA-EPs，检测抗体、中和、T细胞反应，之后攻毒并监测病毒载量和病理。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | 11875119 |
| 胎牛血清 | Gibco | 16000-044 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 白细胞介素-2 | Sigma | 11147528001 | |
| 含GlutaMAX的DMEM | Gibco | 10566016 | |
| Ficoll-Paque PLUS | Cytiva | 17-1440-03 | |
| Dynabeads™人T细胞活化剂CD3/CD28 | Thermo Fisher Scientific | 11131D | |
| mRNA转染验证 | TransIT®-mRNA转染试剂 | Mirus Bio | MIR-2250 |
| Opti-MEM培养基 | Gibco | 31985062 | |
| Western blot | 抗SARS-CoV-2 S1抗体 | Sino Biological | 40150-R007 |
| HRP标记的山羊抗兔抗体 | Invitrogen | 32460 | |
| 流式细胞术 | 抗Flag标签兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 14793S |
| 山羊抗兔IgG H&L (Alexa Fluor® 555) | Abcam | ab150078 | |
| mRNA转染验证 | MG132 | APEXBIO | A2585 |
| 流式细胞术 | 抗V5标签小鼠单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 80076S |
| 山羊抗小鼠IgG H&L (Cy3®) | Abcam | ab97035 | |
| LNP制备 | Quant-iT RiboGreen RNA试剂盒 | Invitrogen | R11490 |
| LNP表征 | Dynapro NanoStar | -- | -- |
| LNP体内分布 | D-荧光素 | Solarbio | D8390 |
| IVIS Spectrum活体成像系统 | PerkinElmer | -- | |
| ELISA | SARS-CoV-2 RBD蛋白 | Sino Biological | 40592-V08H |
| HRP标记的抗小鼠IgG | Invitrogen | A16066 | |
| HRP标记的抗猴IgG | Invitrogen | PA1-84631 | |
| TMB底物 | Sigma | T0440 | |
| ELISpot | 小鼠IFN-γ ELISpot试剂盒 | Abcam | ab64029 |
| 小鼠IL-4 ELISpot试剂盒 | Mabtech | 3311-4HPW-10 | |
| 非人灵长类IFN-γ ELISpot试剂盒 | Mabtech | 3421M-4APT-10 | |
| 非人灵长类IL-4 ELISpot试剂盒 | Mabtech | 3410-2APW-10 | |
| 流式细胞术 | Ghost Dye™ Red 780 | TONBO Biosciences | 13-0865-T100 |
| 抗CD45-Alexa Fluor™ 700 | Invitrogen | 56-0451-82 | |
| 抗CD4-FITC | Tonbo Biosciences | 35-0042-U100 | |
| 抗CD185-Brilliant Violet 605™ | BioLegend | 145513 | |
| 抗PD-1-Brilliant Violet 421™ | BioLegend | 135218 | |
| 抗B220-PerCP-Cyanine5.5 | TONBO Biosciences | 65-0452-U100 | |
| 抗CD95-PE | BioLegend | 152608 | |
| 抗GL-7-APC | BioLegend | 144618 | |
| 抗CD8-PerCP-Cyanine5.5 | TONBO Biosciences | 65-0081-U100 | |
| 抗CD62L-BV421 | BioLegend | 104436 | |
| Cytofix/Cytoperm试剂 | BD Biosciences | BDB554714 | |
| 抗IFN-γ-PE | TONBO Biosciences | 50-7311-U100 | |
| 抗TNF-α-BV421 | BioLegend | 506328 | |
| HLA四聚体染色 | HLA-A*02:01四聚体试剂盒-PE | MBL International Corporation | TB-7300-K1 |
| HLA-A*11:01四聚体试剂盒-PE | MBL International Corporation | TB-7304-K1 | |
| 动物实验 | 抗小鼠抗CD8-α (IgG2b)单克隆抗体 | Bio X Cell | BE0061 |
| IgG2b同型对照单克隆抗体 | Bio X Cell | BE0090 | |
| qRT-PCR | FastKing一步法探针RT-qPCR试剂盒 | Tiangen Biotech | FP314-01 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| HLA-EPs mRNA疫苗的免疫原性评估 | HLA转基因小鼠品系（HLA-A*02:01/DR1和HLA-A*11:01/DR1）、免疫剂量（0.5或10 μg）、免疫方案（两剂，间隔3周）、检测时间（加强后21天）、抗原特异性IFN-γ ELISpot和ICS的肽池浓度（2 μg/ml/肽） 阅读提示：见Methods中'Animal immunization'和Results部分及图2图例。 |
| CD8+ T细胞耗竭实验 | CD8+ T细胞耗竭所用抗体（抗CD8-α，100 μg/只）、给药时间（攻毒前第-1和0天）、耗竭程度验证（外周血流式检测） 阅读提示：见图2g-j和Methods中'SARS-CoV-2 challenge studies'的Mice部分。 |
| 攻毒实验（小鼠） | 攻毒病毒株和剂量（B.1.351 1.4×10^5 PFU；B.1.1.529 2.0×10^5 PFU）、攻毒途径（鼻内）、检测时间（感染后4天）、病毒载量检测方法（空斑实验和qRT-PCR）、病毒载量检测的组织（肺、气管） 阅读提示：见Methods中'SARS-CoV-2 challenge studies'的Mice部分及图3i。 |
| 攻毒实验（恒河猴） | 攻毒病毒株和剂量（Beta 7.0×10^5 PFU）、攻毒途径（气管0.5 ml和鼻腔0.5 ml）、检测时间（0,1,3,5,7天）、病毒载量检测方法（qRT-PCR）、样本类型（咽拭子、肛拭子、肺组织） 阅读提示：见Methods中'SARS-CoV-2 challenge studies'的Macaques部分及图4g,h。 |
| 抗体检测 | ELISA检测的RBD蛋白（不同变异株）、血清稀释系列、HRP标记二抗（抗小鼠IgG或抗猴IgG） 阅读提示：见Methods中'ELISA analysis of serum RBD-specific IgG'。 |