COVID-19患者血浆XL-MS分析
鉴定COVID-19患者血浆中与HDL相关的蛋白相互作用网络，尤其是急性期蛋白。
收集重症ICU患者血浆（n=16），耗尽高丰度蛋白后，使用DSSO交联剂进行XL-MS，鉴定蛋白间相互作用，并进行网络分析。
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交联质谱揭示高密度脂蛋白与SARS-CoV-2刺突糖蛋白之间的相互作用
Cross-Linking Mass Spectrometry Uncovers Interactions Between High-Density Lipoproteins and the SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein.
实验完整度
高包含临床血浆XL-MS、HDL与重组刺突蛋白XL-MS、免疫共沉淀验证、免疫沉淀-MS鉴定新互作、重组蛋白XL-MS与结构建模、细胞感染实验等多个证据层级，并进行了功能验证。
主要模型
COVID-19患者重症监护血浆样本 HEK293T细胞 Vero E6细胞 HEK293T-ACE2细胞
重点核对
血浆样本来自重症COVID-19患者（WHO分级大于5，n=16） HDL通过超速离心或免疫亲和柱分离 XL-MS使用DSSO或DMTMM交联剂，浓度分别为1 mM和10 mM ApoD过表达细胞感染SARS-CoV-2的MOI范围（0.005-0.1） 免疫沉淀使用抗V5和抗myc抗体
摘要
高密度脂蛋白（HDL）水平在2019冠状病毒病（COVID-19）患者中降低，且其降低程度与不良临床结局相关。虽然已知脂蛋白在丙型肝炎病毒的生命周期中发挥关键作用，但它们对冠状病毒（CoV）感染的影响知之甚少。在本研究中，我们利用交联质谱（XL-MS）来确定严重急性呼吸综合征（SARS）-CoV-2刺突糖蛋白的循环蛋白相互作用物。对COVID-19患者血浆进行的XL-MS揭示了HDL蛋白相互作用网络，其中以急性期血清淀粉样蛋白为主，血清淀粉样蛋白A2被证明与载脂蛋白（Apo）D结合。在分离的HDL上进行的XL-MS证实ApoD与SARS-CoV-2刺突蛋白相互作用，但不与SARS-CoV-1刺突蛋白相互作用。SARS-CoV-2刺突蛋白与HDL的其他直接相互作用包括ApoA1和ApoC3。ApoD与刺突蛋白之间的相互作用在细胞中通过免疫沉淀-MS进一步验证，该技术发现了ApoD和刺突蛋白与膜相关孕激素受体组分1之间的新相互作用。机制上，XL-MS结合数据驱动的结构建模确定ApoD可能在刺突蛋白的受体结合域内相互作用。然而，在多种基于细胞的测定中，ApoD过表达对病毒复制或感染性没有影响。因此，SARS-CoV-2刺突蛋白可以与HDL上的载脂蛋白结合，但这些相互作用似乎不会改变感染性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探究SARS-CoV-2刺突糖蛋白与HDL之间的蛋白相互作用及其对病毒感染性的影响。
- 核心机制
- ApoD与刺突蛋白的受体结合域（RBD）结合，区域包括K417等关键残基，可能影响与ACE2的结合。
- 主要证据
- 通过XL-MS在COVID-19患者血浆和分离HDL中鉴定刺突蛋白与ApoD、ApoA1、ApoC3等相互作用；在HEK293T细胞中通过免疫共沉淀验证ApoD与刺突蛋白的相互作用，并通过免疫沉淀-MS发现PGRMC1；重组蛋白XL-MS和结构建模将ApoD结合位点定位至RBD；但ApoD过表达不影响病毒复制或感染。
- 研究意义
- 为SARS-CoV-2刺突蛋白与脂蛋白的相互作用提供了分子见解，并指出ApoD等互作不影响感染性，为理解脂蛋白在病毒传播中的潜在作用提供了线索。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
HDL与SARS-CoV-2刺突蛋白的XL-MS分析
确定SARS-CoV-2刺突蛋白是否与HDL上的蛋白相互作用，并鉴定具体相互作用蛋白。
将从健康供体分离的HDL与重组SARS-CoV-2刺突蛋白混合，使用DSSO交联剂进行XL-MS，鉴定刺突蛋白与HDL蛋白的相互作用网络。
验证ApoD与刺突蛋白的相互作用
在细胞中验证ApoD与SARS-CoV-2刺突蛋白的相互作用，并检查其特异性。
在HEK293T细胞中共表达ApoD-myc和spike-V5，通过抗V5和抗myc免疫共沉淀验证相互作用；同时测试SARS-CoV-1刺突蛋白，对比相互作用特异性。
免疫沉淀-MS鉴定新相互作用
通过质谱分析免疫沉淀样品，寻找ApoD和刺突蛋白的新结合伴侣。
对免疫沉淀样品进行MS分析，比较与等型对照的差异，发现PGRMC1在ApoD和刺突蛋白的沉淀中富集，并通过共转染验证。
重组蛋白XL-MS和结构建模
利用重组蛋白和XL-MS确定ApoD与刺突蛋白的相互作用界面，并结合结构建模预测结合位点。
使用重组全长spike、spike-RBD和ApoD进行XL-MS（DSSO和DMTMM），然后利用DisVis和HADDOCK进行结构建模，确定ApoD与RBD的相互作用界面。
ApoD对SARS-CoV-2复制和感染性的影响
评估ApoD过表达对SARS-CoV-2复制和感染性的功能影响。
在HEK293T-ACE2和Vero E6细胞中过表达ApoD，感染SARS-CoV-2，通过噬斑实验和免疫荧光检测病毒复制和感染率。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 样本采集 | EDTA BD真空采血管 | BD | 362,799 |
| 血浆处理 | High Select Top14高丰度蛋白去除离心柱 | Thermo Fisher | -- |
| 交联反应 | 二琥珀酰亚胺亚砜 | Thermo Fisher | -- |
| DMTMM | Merck | -- | |
| HDL分离 | 溴化钾 | Merck | LP3-5MG |
| 重组蛋白表达 | 重组SARS-CoV-2刺突蛋白 | Thermo Fisher | RP-87680 |
| 重组SARS-CoV-1刺突蛋白 | R&D | 10683-CV-100 | |
| 重组ApoD | Abcam | ab184598 | |
| 重组刺突-RBD | R&D | 10500-CV | |
| 细胞培养 | 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Life Technologies | -- |
| DMEM GlutaMAX培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Life Technologies | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 转染 | FuGENE HD转染试剂 | Promega | -- |
| Opti-MEM培养基 | Thermo Fisher | -- | |
| 蛋白裂解 | 不含EDTA的完全蛋白酶抑制剂 | Roche | -- |
| 免疫沉淀 | Protein G磁珠 | Thermo Fisher | -- |
| 免疫印迹 | Laemmli样本缓冲液 | -- | -- |
| SimplyBlue安全染色液 | Thermo Fisher | -- | |
| 增强化学发光 | GE Healthcare | -- | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 1086431000 |
| DAPI | Sigma | MBD0015-1Ml | |
| SARS-CoV-2核蛋白特异性抗体 | Sino Biological | 40143-R001 | |
| 二抗（抗小鼠IgG，Alexa Fluor 488） | Invitrogen | A21206 | |
| 抗体 | 抗V5抗体 | -- | R960-25 |
| 抗myc抗体 | -- | MA1-980 | |
| 抗SARS-CoV-1刺突抗体 | -- | MA1-41093 | |
| 抗ApoD抗体 | -- | ab108191 | |
| 消化和除盐 | 胰蛋白酶/Lys-C | Promega | -- |
| C18柱 | Agilent Technologies | -- | |
| LC-MS/MS | 纳升液相色谱系统（Dionex UltiMate 3000 RSLC nano） | Dionex | -- |
| 纳升捕集柱（Acclaim PepMap100 C18 Trap） | Thermo Scientific | -- | |
| EASY-Spray PepMap RSLC C18柱 | Thermo Scientific | -- | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| 数据分析 | Proteome Discoverer软件 | Thermo Scientific | -- |
| Mascot | Matrix Science | -- | |
| XlinkX节点 | -- | -- | |
| pLink2 | -- | -- | |
| xiview.org | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 血浆XL-MS | 血浆样本来自重症COVID-19患者（WHO分级>5），收集时间；高丰度蛋白去除方法；DSSO交联浓度和反应时间；质谱数据搜索参数 阅读提示：见Experimental Procedures中的COVID-19 Clinical Cohort和Cross-Linking MS部分 |
| HDL与刺突蛋白XL-MS | HDL分离方法（超速离心）；重组刺突蛋白来源和浓度；交联剂类型和浓度；孵育条件 阅读提示：见Cross-Linking MS部分 |
| 免疫共沉淀验证 | 细胞系和转染方法；抗体特异性；免疫沉淀条件（抗体量、孵育时间、磁珠体积） 阅读提示：见Cell Culture、Immunoprecipitation和Antibodies部分 |
| 病毒复制和感染性实验 | 细胞系（HEK293T-ACE2和Vero E6）；转染效率；感染MOI和时间点；病毒滴度测定方法 阅读提示：见SARS-CoV-2 Replication and Infection Cell Assays部分 |