建立SARS-CoV-2 N蛋白细胞相互作用组
鉴定N蛋白在人类细胞中的相互作用蛋白网络。
在HEK293T细胞中表达S-tag标记的N蛋白，通过S-pulldown亲和纯化，结合LC-MS/MS定量蛋白质组学，筛选高置信度互作蛋白。
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SARS-CoV-2 核衣壳蛋白的新型细胞相互作用组及其生物学意义
A New Cellular Interactome of SARS-CoV-2 Nucleocapsid Protein and Its Biological Implications.
实验完整度
高包含体外细胞模型、定量蛋白质组学、功能缺失/获得/重建实验、机制验证（N-病毒RNA结合、N-N相互作用、N寡聚化）及抗病毒药物筛选，多个独立证据层级。
主要模型
HEK293T细胞 Huh7-ACE2细胞 HEK293细胞 Caco-2细胞 SARS-CoV-2感染模型
重点核对
S-pulldown结合定量质谱的相互作用组分析 DDX1敲低、敲除和过表达对SARS-CoV-2复制的影响 DDX1 ATPase/解旋酶缺陷突变体（K52A、S295E、R296E）的功能分析 N-病毒RNA结合、N-N相互作用和N寡聚化的影响 药物处理（anisomycin和dasatinib）的抗病毒活性
摘要
关于严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）感染的分子细节仍有许多未知。作为最丰富的蛋白质，冠状病毒核衣壳（N）蛋白包裹病毒RNA，作为核糖核蛋白和病毒粒子的结构成分，并参与转录、复制和宿主调控。病毒-宿主相互作用可能为更好地理解病毒在感染过程中如何影响宿主或受宿主影响提供线索，并鉴定有前景的治疗候选物。考虑到N的关键作用，我们通过使用高特异性亲和纯化（S-pulldown）分析结合定量质谱和免疫印迹验证，建立了SARS-CoV-2 N的新型细胞相互作用组，揭示了许多以前未报道的N相互作用宿主蛋白。生物信息学分析显示，这些宿主因子主要参与翻译调控、病毒转录、RNA加工、应激反应、蛋白质折叠和修饰以及炎症/免疫信号通路，这与N在病毒感染中的假定作用一致。随后挖掘了现有的药理学细胞靶标和相应的药物，生成了药物-宿主蛋白网络。据此，我们通过实验鉴定了几种小分子化合物作为SARS-CoV-2复制的新型抑制剂。此外，一个新鉴定的宿主因子DDX1被验证主要通过结合病毒蛋白的N端结构域与N相互作用并共定位。重要的是，功能缺失/获得/重建实验表明，DDX1作为有效的抗SARS-CoV-2宿主因子，抑制病毒复制和蛋白质表达。DDX1的N靶向和抗SARS-CoV-2能力一致地独立于其ATP酶/解旋酶活性。进一步的机制研究表明，DDX1阻碍N的多种活性，包括N-N相互作用、N寡聚化和N-病毒RNA结合，从而可能抑制病毒传播。这些数据为更好地描绘N-细胞相互作用和SARS-CoV-2感染提供了新线索，并可能有助于指导新治疗候选物的开发。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SARS-CoV-2核衣壳蛋白与宿主细胞的相互作用网络及其在病毒感染中的功能和机制是什么？
- 核心机制
- DDX1通过与N蛋白的NTD结构域结合，阻碍N-病毒RNA结合、N-N相互作用和N寡聚化，从而抑制SARS-CoV-2的复制和蛋白表达。
- 主要证据
- 通过S-pulldown和定量质谱鉴定95个高置信度N互作宿主蛋白；免疫共沉淀验证DDX1与N的相互作用；功能实验显示DDX1敲低促进病毒复制，过表达抑制病毒复制；机制实验显示DDX1抑制N-病毒RNA结合、N-N相互作用和N寡聚化。
- 研究意义
- 为理解SARS-CoV-2 N蛋白与宿主细胞的相互作用及其在病毒感染中的作用提供新见解，可能有助于指导抗病毒干预策略的设计。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证N相互作用蛋白
独立验证蛋白质组学鉴定的代表性N互作宿主蛋白。
通过S-pulldown和免疫印迹验证16个代表性宿主蛋白（包括DDX1、DHX9等）与N的特异性相互作用。
基于相互作用组的抗病毒药物筛选
根据N相互作用组鉴定新的抗SARS-CoV-2化合物。
对候选小分子化合物（anisomycin、dasatinib、4-羟基苯丙酮酸、etidronic acid、(S)-3-苯基乳酸）进行抗病毒活性测试。
验证DDX1与N的相互作用和共定位
验证新鉴定的宿主因子DDX1与N蛋白的相互作用及其亚细胞共定位。
通过免疫荧光和共聚焦显微镜观察DDX1与N的共定位；通过S-pulldown和免疫印迹验证相互作用；通过AlphaFold2预测复合物结构并构建N缺失突变体进行结构域映射。
评估DDX1对SARS-CoV-2感染的影响
确定DDX1对SARS-CoV-2复制和蛋白表达的功能影响。
通过DDX1敲低（siRNA）、敲除（CRISPR-Cas9）和过表达实验，检测病毒RNA水平和蛋白表达。
验证DDX1的ATPase/解旋酶活性独立性
验证DDX1的抗病毒功能是否依赖其ATPase/解旋酶活性。
构建ATPase/解旋酶缺陷突变体（K52A、S295E、R296E），进行过表达和回补实验，评估突变体对病毒复制的影响。
机制研究：DDX1对N关键功能的影响
揭示DDX1抑制SARS-CoV-2的分子机制。
通过体外N-病毒RNA结合实验、N-N相互作用实验和化学交联实验检测DDX1对N功能的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| Eagle最低必需培养基 | -- | -- | |
| 药物处理 | 茴香霉素 | MedChemExpress | -- |
| 达沙替尼 | TargetMol | -- | |
| 瑞德西韦 | TargetMol | -- | |
| 苯乳酸 | TargetMol | -- | |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒-8 | MCE | -- |
| 蛋白质印迹/免疫沉淀 | 小鼠抗SARS-CoV-2 N单克隆抗体 | ABclonal | A20142 |
| 小鼠抗β-actin单克隆抗体 | Beyotime | AA128 | |
| 小鼠抗FLAG单克隆抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| 兔抗SARS-CoV-2 N单克隆抗体 | Sino Biological | 40143-R019 | |
| 兔抗SARS-CoV-2 N单克隆抗体 | Sino Biological | 40143-R001 | |
| 兔抗HSPH1单克隆抗体 | ABclonal | A4687 | |
| 兔抗RPS6单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 2217 | |
| 抗S标签多克隆抗体 | Abcam | ab183674 | |
| 兔抗HNRNPU多克隆抗体 | ABclonal | A3917 | |
| 兔抗DDX1多克隆抗体 | Biorbyt | orb341115 | |
| 兔抗DHX9多克隆抗体 | Proteintech | 17721-1-AP | |
| 兔抗LSG1多克隆抗体 | Affinity Biosciences | DF15179 | |
| 兔抗PABPC1多克隆抗体 | ABclonal | A14872 | |
| 兔抗IGF2BP1多克隆抗体 | ABclonal | A1517 | |
| 兔抗LARP1多克隆抗体 | Proteintech | 13708-1-AP | |
| 兔抗RPS8多克隆抗体 | ABclonal | A18377 | |
| 兔抗RPS12多克隆抗体 | ABclonal | A5890 | |
| 兔抗RPL7多克隆抗体 | ABclonal | A5932 | |
| 兔抗RPLP1多克隆抗体 | ABclonal | A6725 | |
| 兔抗HSPA5多克隆抗体 | ABclonal | A11366 | |
| 兔抗HSPA4多克隆抗体 | Proteintech | 21206-1-AP | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor-488山羊抗小鼠IgG | Abcam | ab150113 |
| Alexa Fluor-647山羊抗兔IgG | Abcam | ab150079 | |
| 免疫印迹 | 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG | Sigma-Aldrich | A6154 |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG | Sigma-Aldrich | A4416 | |
| RNA提取和RT-PCR | MiniBEST病毒RNA提取试剂盒 | TAKARA | -- |
| RT-PCR | PrimeScript RT试剂盒（含基因组DNA去除） | TAKARA | -- |
| SYBR Green实时PCR预混液 | TAKARA | -- | |
| 化学交联 | 二琥珀酰亚胺辛二酸酯 | Thermo Fisher | -- |
| RNA酶抑制 | RiboLock RNA酶抑制剂 | Thermo Fisher | -- |
| 转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher | -- |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher | -- | |
| JetPRIME转染试剂 | Polyplus | -- | |
| 细胞核染色 | Hoechst 33258染料 | Beyotime | -- |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| 亲和纯化 | S蛋白琼脂糖 | MBL | -- |
| 质谱分析 | TripleTOF 5600质谱仪 | SCIEX | -- |
| Eksigent microLC 415系统 | SCIEX | -- | |
| C18捕集柱 | Agilent Technologies | -- | |
| C18分析柱 | Eksigent | -- | |
| 蛋白质纯化 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche Applied Science | -- |
| 银染 | 银染试剂盒 | Thermo Fisher | -- |
| 细胞成像 | Andor Dragonfly 202显微镜 | Oxford Instruments | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 蛋白相互作用组分析 | HEK293T细胞转染N.STAG或空载体，三个生物学重复；S-pulldown缓冲液成分（25 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100）；蛋白酶抑制剂；S-protein agarose孵育时间（4°C 6小时）；质谱参数（TripleTOF 5600, 30分钟梯度, 流动相A/B）；MaxQuant分析参数（LFQ, FDR<1%） 阅读提示：Methods: S-Pulldown and Silver Staining; AP-MS; Raw Data Processing, Protein Identification, and Quantification |
| 药物抗病毒试验 | Huh7-ACE2细胞预处理药物1小时；SARS-CoV-2感染（0.05 MOI）24小时；药物浓度（anisomycin和dasatinib的IC50和CC50计算）；CCK8测定细胞活力；remdesivir（10 μM）作为阳性对照 阅读提示：Figure 3 legend; Methods: Cell and Virus; Results: Experimental Screening Based on the Interactome Identifies Anisomycin and Dasatinib as Anti-SARS-CoV-2 Agents |
| DDX1-KD/KO/过表达实验 | siRNA序列（Table 1）；转染时间（48小时）和感染MOI（0.05）；qPCR引物（Table 2）；Western blot抗体 阅读提示：Methods: Plasmid Construct and siRNA; Real-Time qRT-PCR; Results: DDX1 Is a Host Cell Restriction Factor Against SARS-CoV-2 Infection |
| N蛋白功能实验 | N-病毒RNA结合实验：RNase抑制剂（1 U/μl），病毒gRNA拷贝数（~2×10^5）；N-N相互作用实验；N寡聚化实验：DSS浓度（0.5 mM），交联时间（37°C 30分钟），淬灭缓冲液（1M Tris pH 7.5） 阅读提示：Figure 6 legend; Methods: S-Pulldown and Silver Staining; Results: DDX1 Impedes the N–Genome RNA Binding, N–N Interaction, and N Oligomerization |