建立人原代气道类器官生物库及单细胞图谱
验证不同体外培养条件下细胞多样性和转录组保真度。
从27例供体肺组织分离细胞，建立83个类器官系，在3D-AO、ALI-Om、ALI-Pm三种条件下培养，进行scRNA-seq测序、免疫荧光验证和生物信息学分析。
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体外多培养系统的单细胞图谱揭示了人肺中的体内谱系轨迹和细胞状态
A single-cell atlas of in vitro multiculture systems uncovers the in vivo lineage trajectory and cell state in the human lung.
实验完整度
高包含大规模单细胞转录组、多组学、类器官/ALI模型、病毒感染实验、功能验证（细胞因子处理）和机制验证（scATAC-seq）。
主要模型
3D气道类器官（3D-AO） ALI-Om二维培养 ALI-Pm二维培养 人肺组织样本
重点核对
27例供体来源（19正常，8患病） 3D-AO、ALI-Om、ALI-Pm三种培养条件 细胞因子处理浓度：IL-13 1ng/ml, IL-1β 10ng/ml, IL-6 10ng/ml 病毒感染MOI=1.0，感染后培养3天 scRNA-seq和scATAC-seq数据整合分析
摘要
我们展示了来自27位个体供体的正常和患病肺的人原代气道上皮体外多培养系统的深入单细胞图谱。我们的大规模单细胞分析鉴定了人远端肺中罕见气道上皮细胞类型的新细胞状态和分化轨迹。通过整合人肺组织的单细胞数据集，我们发现富集于肺和慢性呼吸系统疾病患者来源的类器官中的免疫启动亚群。为了展示我们平台的充分潜力，我们进一步说明了体外气道模型对各种呼吸道病毒感染的转录组反应。我们的工作构成了人原代肺细胞体外表征及其与体内人体组织相关性的细胞和分子特征的单细胞路线图。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 体外培养的人原代气道模型能否在转录组和谱系层面忠实复制体内肺组织特性，并用于研究疾病和感染反应？
- 核心机制
- 基底细胞通过过渡性气道基底（TAB）细胞状态向罕见上皮谱系（如PNEC、离子细胞、簇细胞）分化，其中ASCL1转录因子结合位点在TAB细胞中开放；免疫启动细胞状态可由促炎细胞因子诱导。
- 主要证据
- 大规模单细胞转录组分析鉴定10种以上细胞类型，scATAC-seq证实TAB细胞与罕见细胞群的染色质开放性相似；整合人肺组织数据发现免疫启动亚群富集；病毒感染实验显示转录组变化和免疫反应。
- 研究意义
- 该单细胞图谱可作为研究人肺干细胞活性、谱系轨迹的数据库，并可作为临床前模型指导个体化病毒治疗方案的制定。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
追踪罕见上皮细胞谱系分化轨迹
利用体外模型追踪罕见上皮细胞的起源和分化路径。
使用稀有细胞评分和Monocle3拟时序分析，结合scATAC-seq揭示TAB细胞向罕见细胞分化的染色质开放状态。
比较体外模型与体内组织转录组差异
确定体外模型与体内肺组织的细胞组成和分子程序相似性。
整合体外数据与Human Lung Cell Atlas数据，进行差异表达和GSEA分析，鉴定免疫启动细胞状态。
验证慢性呼吸系统疾病和炎症对免疫启动状态的影响
研究疾病、年龄、吸烟和细胞因子处理对免疫启动细胞比例的影响。
对3D-AO进行细胞因子处理，并参考映射IPF、COPD、CF等患者数据，分析免疫启动细胞比例。
模拟呼吸道病毒感染反应
利用ALI模型检测不同呼吸道病毒感染的细胞嗜性和转录组反应。
用SARS-CoV-2变异株、MERS-CoV、流感病毒以MOI=1.0感染ALI-Om，通过scRNA-seq分析感染率和免疫反应。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Advanced DMEM/F12培养基 | Gibco | -- |
| HEPES缓冲液 | Gibco | -- | |
| Glutamax添加剂 | Gibco | -- | |
| 两性霉素B | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 组织处理 | RNAlater溶液 | Invitrogen | -- |
| 细胞分离 | gentleMACS Octo Dissociator带加热器 | Miltenyi Biotec | -- |
| 70微米细胞滤网 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 红细胞裂解液 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 细胞培养 | Matrigel基质胶 | Corning | -- |
| Y-27632 | Tocris | -- | |
| TrypLE Express消化液 | Gibco | -- | |
| 细胞处理 | 白细胞介素-13 | Biolegend | -- |
| 白细胞介素-1β | Biolegend | -- | |
| 白细胞介素-6 | R&D Systems | -- | |
| 细胞培养 | Transwell插入小室 | Corning | -- |
| PneumaCult-Ex Plus培养基 | STEMCELL Technologies | -- | |
| PneumaCult-ALI培养基 | STEMCELL Technologies | -- | |
| 单细胞测序 | 30微米SmartStrainer滤网 | Miltenyi Biotec | -- |
| ReadyCount Green/Red活性染料 | Invitrogen | -- | |
| Countess 3 FL自动细胞计数仪 | Thermo Fisher | -- | |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| Chromium Next GEM Chip J芯片 | 10x Genomics | -- | |
| NovaSeq 6000测序系统 | Illumina | -- | |
| 免疫荧光染色 | Cell Recovery Solution | Corning | -- |
| Triton X-100 | -- | -- | |
| 驴血清 | Jackson ImmunoResearch | -- | |
| 抗CK5抗体 | Biolegend | 905904 | |
| 抗TP63抗体 | Thermo Fisher | MA1-21871 | |
| 抗MUC5AC抗体 | Cell Signaling Technology | 61193 | |
| 抗SCGB1A1抗体 | R&D Systems | MAB4218 | |
| 抗乙酰化α-微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 5335 | |
| 抗SARS-CoV核蛋白抗体 | Sino Biological | 40143-MM05 | |
| 抗甲型流感核蛋白抗体 | Meridian | C87050M | |
| DAPI | Sigma | -- | |
| Vectashield Plus抗荧光淬灭封片剂 | Vector Laboratories | H-1900 | |
| Leica SP8共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| LSM700共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| 定量PCR | RNeasy Mini Kit | Qiagen | -- |
| 第一链cDNA合成试剂盒 | Takara | -- | |
| TB Green Premix Ex Taq II | Takara | -- | |
| Viia7实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher | -- | |
| 病毒制备 | DMEM培养基 | Welgene | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 甲基纤维素 | Sigma | -- | |
| VeroE6细胞系 | ATCC | CRL-1586 | |
| MDCK细胞系 | ATCC | CCL-34 | |
| 电镜 | EMbed-812树脂 | EMS | -- |
| 超薄切片机(RMC MT-XL) | RMC | -- | |
| 醋酸铀 | -- | -- | |
| 柠檬酸铅 | -- | -- | |
| 透射电子显微镜(JEM-1400) | JEOL | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 人肺组织处理与类器官建立 | 供体数量、正常/患病分组、组织存储条件、消化方法、细胞培养条件（Matrigel浓度、Y-27632浓度、培养时间） 阅读提示：Methods: Human tissues, Isolation and culture of human primary distal airway organoids |
| ALI培养 | 细胞接种密度（200K）、基质胶包被浓度、ALI培养基类型、诱导分化天数（21天） 阅读提示：Methods: Air-liquid interface (ALI) culture |
| 细胞因子处理 | IL-13浓度1ng/ml、IL-1β浓度10ng/ml、IL-6浓度10ng/ml、处理时长（3周） 阅读提示：Methods: Isolation and culture of human primary distal airway organoids |
| 病毒制备与感染 | 病毒株（包括变异株、MERS-CoV、流感A）、MOI=1.0、感染时间（2h）及培养时间（3天）、生物安全等级 阅读提示：Methods: Virus preparation, Viral infection |
| 单细胞测序 | 测序平台（10x Genomics）、细胞数、质量控制参数（线粒体基因比例<10%、基因数>200）、样本合并策略、比对参考基因组、demultiplex方法 阅读提示：Methods: Single-cell RNA sequencing, Computational methods |