刺突蛋白突变体构建与表达检测
构建各变异株刺突蛋白表达质粒，并检测其在细胞中的表达水平。
通过定点重叠延伸PCR生成变异株刺突蛋白基因，构建pcDNA3.1-S质粒；将刺突蛋白与mCherry融合，转染HEK293T细胞，利用流式细胞术检测mCherry/GFP荧光比值。
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SARS-CoV-2刺突蛋白突变体改变的hACE2结合亲和力和S1/S2切割效率影响病毒进入细胞
Altered hACE2 binding affinity and S1/S2 cleavage efficiency of SARS-CoV-2 spike protein mutants affect viral cell entry.
实验完整度
高包含体外结合实验（SPR）、假病毒进入实验、蛋白表达与切割分析（Western blot）、跨物种ACE2嗜性分析等多个独立证据层级，并进行了功能验证。
主要模型
HEK293T细胞及其稳定表达hACE2/TMPRSS2或动物ACE2的衍生细胞系 Caco-2细胞 SARS-CoV-2假病毒（基于HIV-1慢病毒系统）
重点核对
假病毒加入量以HIV-1 p24含量（5 ng）进行标准化 293T-hACE2-TMPRSS2细胞中TMPRSS2的共表达对Omicron和Mu假病毒进入效率无显著影响 RBD和全长刺突蛋白与hACE2的结合亲和力（KD值）通过SPR测定，使用1:1 Langmuir模型 刺突蛋白S1/S2切割效率通过Western blot检测，并以S1与总刺突蛋白的比率量化
摘要
SARS-CoV-2变异株不断出现，阻碍了公共卫生措施控制感染数量。虽然已明确不同变异株刺突蛋白中的突变直接影响病毒进入宿主细胞，但仍需要进一步扩展系统和多方面的比较。在这里，我们全面研究了刺突蛋白突变对八种关切变异株（VOC）和关注变异株（VOI）的刺突表达和蛋白水解激活、结合亲和力、病毒进入效率和宿主嗜性的影响。我们发现Omicron的全长刺突及其受体结合域（RBD）与hACE2结合的亲和力与野生型相似。此外，与野生型相比，Alpha、Beta、Delta和Lambda假病毒进入细胞的能力显著增强，而Omicron假病毒进入细胞的能力略有增加，表明观察到的Omicron变异株传播速度的大幅增加与其与hACE2的亲和力无关。我们还发现，Omicron和Mu的刺突蛋白S1/S2切割效率较低，并且比其他变异株更不有效地利用TMPRSS2进入宿主细胞，表明它们更倾向于通过内吞途径进入宿主细胞。此外，我们测试的所有变异株假病毒都能进入表达动物ACE2的细胞。特别是对大鼠和小鼠的感染潜力显著增加，强烈提示啮齿动物可能成为病毒进化的储存库。从这项研究中获得的见解为针对性的流行病控制方法提供了有价值的指导，并有助于更好地理解SARS-CoV-2的进化。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SARS-CoV-2各变异株刺突蛋白突变如何影响其与hACE2的结合亲和力、蛋白切割、细胞进入效率以及宿主嗜性？
- 核心机制
- Omicron和Mu的刺突蛋白S1/S2切割效率降低，导致其不能有效利用TMPRSS2进入宿主细胞，而更倾向于内吞途径。
- 主要证据
- 通过SPR检测RBD和全长刺突蛋白与hACE2的亲和力；通过Western blot分析刺突蛋白切割；利用假病毒系统评估进入293T-hACE2、Caco-2细胞及表达动物ACE2的细胞的能力。
- 研究意义
- 研究结果为评估变异株传播性和跨物种传播风险提供了重要依据，有助于流行病控制和理解SARS-CoV-2的进化。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
刺突蛋白S1/S2切割效率分析
检测各变异株刺突蛋白在伪病毒颗粒和细胞裂解物中的切割效率。
制备假病毒，并用Western blot分析刺突蛋白条带；同时转染刺突蛋白表达质粒至HEK293T细胞，裂解后检测S1和S0蛋白水平。
RBD和全长刺突蛋白与hACE2结合亲和力测定
通过SPR测量RBD突变体和全长刺突蛋白突变体与hACE2的结合动力学和亲和力。
表达并纯化RBD蛋白，利用Biacore 8K进行SPR分析，hACE2-hFc作为配体，注入不同浓度梯度的分析物，计算ka、kd和KD。
假病毒进入效率测定
评估各变异株假病毒在不同细胞系中的进入效率。
包装表达变异株刺突蛋白的慢病毒假病毒，以p24 ELISA定量，感染293T-hACE2、293T-hACE2-TMPRSS2、Caco-2细胞，检测荧光素酶活性。
跨物种ACE2嗜性分析
检测各变异株假病毒对表达不同动物ACE2的细胞的进入能力。
用表达不同ACE2直系同源物（人、小鼠、大鼠、恒河猴、白尾鹿）的293T细胞，感染假病毒并测定进入效率。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证结合亲和力
验证免疫效应
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 载体构建 | pcDNA3.1-S-WT | Honorgene | HG-VJH1153 |
| pcDNA3.1 (+) | Addgene | V790-20 | |
| PB513B-1 | Fenghui | -- | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| EMEM培养基 | Sigma-Aldrich | -- | |
| StarFect 293瞬时转染培养基 | Genstar | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 稳定细胞系构建 | PA210PA-1 | Fenghui | -- |
| PB200PA-1 | Fenghui | -- | |
| FACSAria IIIu | BD Biosciences | -- | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 假病毒制备 | 0.45 μm滤膜 | Millipore | -- |
| 假病毒定量 | p24 ELISA试剂盒 | Key-Bio Biotech | -- |
| 假病毒进入检测 | 荧光素酶检测系统 | Beyotime | -- |
| RBD蛋白表达 | StarFect高效转染试剂 | Genstar | -- |
| 蛋白纯化 | HisTrap excel层析柱 | Cytiva | -- |
| Amicon超滤装置 | Millipore | 10 | |
| 蛋白定量 | BCA蛋白质定量试剂盒 | Beyotime | -- |
| SPR | Biacore 8K | GE Healthcare Life Sciences | -- |
| Protein A芯片 | Cytiva | -- | |
| ACE2-hFc | SinoBiological | 10108-H02H | |
| 甘氨酸1.5 | Cytiva | -- | |
| Western blot | 5×上样缓冲液 | Genstar | -- |
| RIPA裂解液 | Beyotime | -- | |
| Amicon Ultra-4离心过滤器 | Millipore | 100 | |
| 小鼠抗SARS-CoV-2刺突蛋白抗体 | Sino Biological | 40592-MM117 | |
| 小鼠抗HIV-1 p24蛋白单克隆抗体 | Sino Biological | 11695-MM15 | |
| 小鼠抗GAPDH抗体 | Abcam | ab8245 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG | Abcam | ab6789 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Abcam | ab6721 | |
| 统计分析 | GraphPad Prism | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 刺突蛋白表达检测 | mCherry/GFP荧光比值；转染试剂及其用量；转染后检测时间（24小时）；细胞系（HEK293T） 阅读提示：见Materials and methods 2.7及图2A图注 |
| S1/S2切割效率分析 | 细胞裂解物和假病毒颗粒中S1/S2条带强度；抗体（抗RBD）和对照抗体；S1与总刺突蛋白比值 阅读提示：见Materials and methods 2.8及图2B-E图注 |
| SPR结合实验 | hACE2-hFc浓度（10 μg/mL）；分析物浓度范围（200-0 nmol/L）；流速和接触时间；再生条件 阅读提示：见Materials and methods 2.6及图3图注 |
| 假病毒进入实验 | p24添加量（5 ng）；细胞密度（20,000 cells/100 μL）；转染质粒量（psPAX2 7 μg, pLVX 7 μg, S蛋白6 μg）；感染和检测时间 阅读提示：见Materials and methods 2.4及图4图注 |
| 跨物种ACE2嗜性 | 表达ACE2直系同源物的稳定细胞系（293T-mACE2等）；是否共表达TMPRSS2；假病毒添加量（5 ng p24） 阅读提示：见Materials and methods 2.3和2.4及图5图注 |
| 统计学分析 | 重复次数（3-4次）；t检验或单因素方差分析；P值阈值（0.05） 阅读提示：见Materials and methods 2.9 |