鉴定TEAD1结合的LCR共因子
找出与HPV16 LCR通过TEAD1结合的转录共因子
利用生物素化的HPV16 LCR探针（WT和TEAD1结合位点突变体）进行DNA下拉实验，结合DIA-MS分析，鉴定与WT LCR结合增强的蛋白质，包括S100A9。
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核促炎细胞因子S100A9通过转录因子TEAD1增强人乳头瘤病毒癌基因的表达
Nuclear proinflammatory cytokine S100A9 enhances expression of human papillomavirus oncogenes via transcription factor TEAD1.
实验完整度
高包含体外DNA下拉联合质谱鉴定、细胞核定位与结合验证、功能敲低与过表达、报告基因及细胞增殖和药物敏感性实验，以及ChIP和Co-IP等机制验证，层级丰富。
主要模型
CaSki细胞（HPV16阳性宫颈癌细胞系） HeLa细胞（HPV18阳性宫颈癌细胞系） W12细胞（HPV16阳性宫颈角质形成细胞） HaCaT细胞（HPV阴性永生化皮肤角质形成细胞）
重点核对
使用HPV16 LCR野生型（WT）和TEAD1结合位点突变型（Mut）探针进行DNA下拉实验，验证S100A9特异性结合 S100A9与TEAD1的直接相互作用通过体外翻译蛋白的免疫共沉淀验证 TPA处理（200 ng/mL，4小时）诱导S100A9核表达及与LCR结合 siRNA敲低S100A9在CaSki和HeLa细胞中降低E6*I mRNA和E7蛋白水平 核定位信号融合的S100A9（NS100A9）过表达增强P97启动子活性和细胞增殖
摘要
人乳头瘤病毒（HPV）癌基因E6和E7的转录受病毒基因组的长控制区（LCR）调控。尽管已有多种转录因子被报道与LCR结合，但关于调节这些转录因子相关HPV癌基因表达的转录共因子的了解甚少。在此，我们通过体外DNA下拉实验纯化了宫颈癌细胞中的核蛋白，并进行了蛋白质组学分析，以鉴定通过转录因子TEAD1与HPV16 LCR结合的转录共因子。我们检测到促炎细胞因子S100A9，它定位于宫颈癌细胞的细胞核中，并通过与TEAD1直接相互作用而与LCR结合。用促炎性佛波酯处理宫颈癌细胞后，核S100A9水平及其与LCR的结合增加。敲低S100A9降低了HPV癌基因的表达，并减少了宫颈癌细胞的生长及其对顺铂的敏感性，而利用核定位信号强制核表达S100A9则产生相反的效果。因此，我们得出结论：核S100A9通过TEAD1与HPV LCR结合，并通过作为转录共激活因子增强病毒癌基因的表达。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 炎症如何通过影响HPV癌基因表达来促进宫颈癌发生？即鉴定并验证通过TEAD1与HPV LCR结合的转录共因子及其作用。
- 核心机制
- 核S100A9作为TEAD1的转录共激活因子，直接与TEAD1结合并增强HPV LCR驱动的E6和E7转录。
- 主要证据
- DNA下拉联合质谱鉴定S100A9；Co-IP验证直接相互作用；ChIP显示S100A9结合HPV16/18 LCR；敲低S100A9降低E6*I mRNA和E7蛋白，核定位S100A9增强P97启动子活性。
- 研究意义
- 揭示了炎症与病毒致癌之间的分子联系，提示S100A9/TEAD1相互作用抑制剂可能用于抑制HPV癌基因表达，核S100A9可能作为宫颈癌进展的预后生物标志物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证S100A9的核定位和炎症诱导
确认S100A9在宫颈癌细胞中的核定位及其是否受炎症刺激诱导
通过免疫荧光染色检测S100A9在CaSki和HeLa细胞中的定位，并用TPA处理CaSki细胞后进行细胞分级和免疫印迹分析，观察S100A9的核表达变化。
证明S100A9与LCR的直接结合
验证S100A9是否直接结合HPV LCR以及是否通过TEAD1介导
利用纯化的S100A9-HA和FLAG-TEAD1进行DNA下拉实验，检测S100A9与LCR的结合是否依赖TEAD1；通过Co-IP验证内源性和直接相互作用；通过ChIP检测S100A9在细胞中与HPV16/18 LCR的结合。
验证S100A9对HPV癌基因表达的影响
确定S100A9是否影响HPV E6和E7的表达
在CaSki、HeLa和W12细胞中敲低S100A9，检测E6*I mRNA和E7蛋白水平的变化；在HaCaT细胞中利用报告基因检测P97启动子活性；过表达S100A9或核定位S100A9观察对E6*I mRNA和E7蛋白的影响。
评估S100A9对细胞生长和化疗敏感性的影响
探讨S100A9对宫颈癌细胞增殖和顺铂敏感性的功能影响
通过慢病毒表达shRNA敲低S100A9，检测细胞增殖和顺铂处理后的存活率；同时过表达核定位S100A9，检测细胞增殖和顺铂敏感性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | 文中未明确说明 | -- |
| 角质形成细胞无血清培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 牛垂体提取物 | 文中未明确说明 | -- | |
| 人重组表皮生长因子 | 文中未明确说明 | -- | |
| TPA处理 | 12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯 | FUJIFILM Wako Pure Chemical | -- |
| DNA下拉 | Dynabeads/M-280链霉亲和素磁珠 | Dynal Biotech | -- |
| 免疫荧光 | 抗S100A9抗体 | Sino Biological | 11145-R018 |
| Alexa Fluor 546偶联抗兔IgG抗体 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ProLong Gold防淬灭封片剂（含DAPI） | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 免疫印迹 | 抗HA标签抗体 | Merck | 12013819001 |
| 抗TEAD1抗体 | BD Transduction Laboratories | 610922 | |
| 抗TEAD4抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-101184 | |
| 抗VGLL1抗体 | Merck | HPA042403, HPA064616 | |
| 抗S100A9抗体 | Proteintech | 26992-1-AP | |
| 抗Ku70抗体 | GeneTex | GTX101820 | |
| 抗HPV16 E7抗体 | Thermo Fisher Scientific | 28-0006 | |
| 抗HPV16 E7抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-6981 | |
| 抗HPV18 E7抗体 | Abcam | ab100953 | |
| 抗p53抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-126 | |
| 抗GAPDH抗体 | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 015-25473 | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-32293 | |
| 抗核纤层蛋白B1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-6216 | |
| 抗c-Fos抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-52 | |
| 免疫共沉淀 | Sera-Mag SpeedBeads蛋白A/G磁性颗粒 | Cytiva | -- |
| 抗TEAD1抗体（P28347） | Cusabio | P28347 | |
| 抗S100A9抗体（11145-R018） | Sino Biological | 11145-R018 | |
| 正常兔IgG | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | |
| ChIP | ChIP交联金 | Diagenode | -- |
| SimpleChIP Plus酶法染色质免疫沉淀试剂盒 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗S100A9抗体（GTX129575） | GeneTex | GTX129575 | |
| 正常兔IgG（2729S） | Cell Signaling Technology | 2729S | |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 非靶向对照siRNA | Horizon Discovery | D-001206-13 | |
| S100A9 siRNA | Horizon Discovery | M-011384-02 | |
| TEAD1 siRNA | Horizon Discovery | L-012603-00 | |
| 报告基因实验 | phRG-TK质粒 | Promega | -- |
| 双荧光素酶检测系统 | Promega | -- | |
| Arvo MX发光检测仪 | PerkinElmer | -- | |
| 病毒转导 | shS100A9载体质粒 | Merck | TRCN0000425882 |
| 细胞活力 | 细胞计数试剂盒-8 | Dojindo | -- |
| 顺铂 | Adipogen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| DNA下拉实验 | 细胞核提取缓冲液成分、探针序列、磁珠类型、孵育时间和温度 阅读提示：Materials and Methods: DNA-pulldown assay |
| TPA处理 | TPA浓度（200 ng/mL）、处理时间（4小时）、血清饥饿条件（0.5% FBS 24小时） 阅读提示：Materials and Methods: TPA treatment |
| 免疫共沉淀 | 抗体类型、磁珠、核提取缓冲液、Benzonase处理 阅读提示：Materials and Methods: Co-IP experiment |
| ChIP | 交联方法、抗体、磁珠、引物序列 阅读提示：Materials and Methods: ChIP assay |
| siRNA敲低 | siRNA目录号、转染试剂、转染后时间 阅读提示：Materials and Methods: siRNA transfection |
| 细胞活力 | 细胞接种密度（1000或2000细胞/孔）、检测时间点、顺铂浓度和处理时间 阅读提示：Materials and Methods: Cell viability assay |