分析肿瘤组织中PD-1和CTLA-4共表达
评估PD-1和CTLA-4在肿瘤中的共表达情况，为设计双特异性抗体提供依据。
使用TCGA PanCan Atlas数据，通过cBioPortal分析多种肿瘤类型中PD-1和CTLA-4 mRNA表达水平的相关性。
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Cadonilimab，一种具有反式结合和增强靶点结合亲合力的四价PD-1/CTLA-4双特异性抗体
Cadonilimab, a tetravalent PD-1/CTLA-4 bispecific antibody with trans-binding and enhanced target binding avidity.
实验完整度
高包含体外细胞实验（ELISA、FACS、混合淋巴细胞反应）和功能验证（ADCC、ADCP、CDC），并进行了trans-binding实验和TCGA数据分析。
主要模型
293T细胞（稳定转染人PD-1或CTLA-4） CHO-K1细胞（表达PD-1和/或CTLA-4） 人外周血单个核细胞（PBMCs）与树突状细胞（DCs）共培养 Jurkat细胞（表达PD-1）
重点核对
靶点密度：高密度（50 nM）PD-1和CTLA-4 vs 低密度（10 nM）PD-1 Fc突变：L235A/L236A/G238A 效应功能检测：ADCC、ADCP、CDC和细胞因子释放 细胞系：293T-CTLA4-PD1、CHO-K1-PD1-CTLA4、Raji-PDL1 抗体浓度：3、30、300 nM
摘要
临床研究表明，靶向细胞毒性T淋巴细胞抗原-4（CTLA-4）和程序性细胞死亡-1（PD-1）的抗体的联合治疗与PD-1抗体单药相比，显著改善了临床获益。然而，这种联合的广泛应用受到毒性的限制。Cadonilimab（AK104）是一种对称的四价双特异性抗体，具有结晶片段（Fc）-null设计。除了表现出与CTLA-4和PD-1抗体联合相似的生物学活性外，cadonilimab在高密度PD-1和CTLA-4的环境中比在低密度PD-1的环境中具有更高的结合亲合力，而单特异性抗PD-1抗体不表现出这种差异活性。由于不与Fc受体结合，cadonilimab表现出极小的抗体依赖性细胞毒性、抗体依赖性细胞吞噬作用和白细胞介素-6（IL-6）/IL-8释放。这些特征可能都促成了cadonilimab在临床中观察到的显著较低的毒性。cadonilimab在肿瘤样环境中的更高结合亲合力和Fc-null设计可能导致药物在肿瘤中更好的滞留，并有助于在实现抗肿瘤功效的同时实现更好的安全性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何设计一种PD-1/CTLA-4双特异性抗体，以在保持抗肿瘤功效的同时降低毒性？
- 核心机制
- 四价设计使cadonilimab在高密度PD-1和CTLA-4存在下具有更高结合亲合力，并可通过转结合连接表达不同靶点的细胞；Fc-null设计消除了Fc介导的效应功能，减少IL-6/IL-8释放，从而降低毒性。
- 主要证据
- 通过ELISA和FACS证明cadonilimab与PD-1和CTLA-4结合，并阻断配体相互作用；混合淋巴细胞反应显示IL-2和IFN-γ分泌增加；trans-binding实验显示细胞交联；Fc功能实验显示ADCC、ADCP、CDC和细胞因子释放减少。
- 研究意义
- cadonilimab可能代表一种有前景的癌症免疫疗法，通过其分子设计和临床数据支持，提供更安全有效的治疗选择。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
抗体构建和结合活性检测
验证cadonilimab对PD-1和CTLA-4的结合活性和竞争性阻断能力。
通过ELISA和FACS检测cadonilimab与PD-1和CTLA-4的结合及竞争性阻断配体结合。
评估T细胞活化能力
检测cadonilimab阻断PD-1和CTLA-4通路后能否激活T细胞并促进细胞因子分泌。
在混合淋巴细胞反应中，将人PBMCs与DCs或Raji-PDL1细胞共培养，加入不同浓度的cadonilimab，检测IL-2和IFN-γ分泌。
验证四价结合亲合力和转结合能力
探究cadonilimab在高密度抗原下的结合亲合力增强及其连接不同细胞的能力。
通过Fortebio分析比较高密度（50 nM）和低密度（10 nM）下的结合亲合力；通过显微镜和FACS观察细胞交联。
评估Fc-null设计对效应功能的影响
验证Fc突变是否消除Fc受体介导的效应功能并减少炎症细胞因子释放。
测量ADCC、ADCP、CDC和IL-6/IL-8释放。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| ELISA结合实验 | CTLA-4鼠Fc融合蛋白 | Akeso Biopharma | -- |
| PD-1鼠Fc融合蛋白 | Akeso Biopharma | -- | |
| HRP标记的山羊抗人IgG | Jackson | 109-035-088 | |
| FACS结合实验 | FITC标记的山羊抗人IgG | Jackson | 109-095-098 |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | V900933-1 | |
| 流式分析 | FACSCalibur流式细胞仪 | BD | -- |
| FACS竞争结合实验 | FITC标记的链霉亲和素 | Biolegend | 405202 |
| FITC标记的抗小鼠二抗 | BD | 555988 | |
| BLI分析 | Fortebio OctetQKe | -- | -- |
| Fortebio Octet Red96e | -- | -- | |
| 转结合实验 | Hoechst 33342 | Biohao | C0420 |
| ADCC实验 | Ficoll-PaqueTM Plus | GE | 17-1440-02 |
| LDH检测试剂盒 | Roche | 11644793001 | |
| CDC实验 | 正常人血清 | Quidel | A113 |
| ADCP实验 | 鼠巨噬细胞集落刺激因子 | Peprotech | 315-02 |
| CFSE | Biolegend | 423801 | |
| APC偶联的山羊抗小鼠/人CD11b | Biolegend | 101212 | |
| ADCR实验 | 人巨噬细胞集落刺激因子 | Peprotech | 300-25 |
| IFN-γ | Sinobiological | 11725-HNAS-100 | |
| 脂多糖 | Sigma | L4391 | |
| IL-8 ELISA试剂盒 | Dakewe | 1110802 | |
| IL-6 ELISA试剂盒 | Dakewe | 1110602 | |
| 混合淋巴细胞反应 | IL-4 | Peprotech | 200-04 |
| 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | Peprotech | 300-03 | |
| IL-2 ELISA试剂盒 | Dakewe | 1110202 | |
| IFN-γ ELISA试剂盒 | Dakewe | 1110002 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 靶点密度模拟 | 高密度：PD-1 (50 nM)和CTLA-4 (50 nM)；低密度：PD-1 (10 nM) 阅读提示：Figure 3及对应Methods部分 |
| Fc突变设计 | Fc区突变：L235A/L236A/G238A 阅读提示：Materials and methods - Antibody construction |
| 效应功能检测 | ADCC：293T-CTLA4-PD1细胞，PBMCs效靶比30:1；ADCP：CHO-K1-PD1-CTLA4细胞与巨噬细胞共培养；CDC：CHO-K1-PD1-CTLA4细胞与2%人血清孵育 阅读提示：Materials and methods - ADCC assay, CDC assay, ADCP assay |
| T细胞活化实验 | PBMCs与DCs比例10:1（1e5:1e4），孵育5天；PBMCs与Raji-PDL1共培养，抗体浓度3、30、300 nM，孵育3天 阅读提示：Materials and methods - 混合淋巴细胞反应部分 |