AnxA6的SUMO化修饰促进EGFR-PKCα复合物形成以抑制上皮性肿瘤生长

AnxA6蛋白已知在EGF刺激下抑制表皮生长因子受体（EGFR）-细胞外信号调节激酶（ERK）1/2信号通路。然而，AnxA6灭活EGFR和ERK1/2磷酸化的生化机制在癌细胞中尚未完全阐明。方法：细胞瞬时共转染pFlag-AnxA6、pHA-UBC9和pHis-SUMO1质粒，通过免疫沉淀富集SUMO化的AnxA6，并用SUMO1抗体通过Western blot检测AnxA6的SUMO化修饰水平。比较化学SUMO化抑制剂处理后AnxA6的SUMO化水平。进一步通过LC-MS/MS和氨基酸位点突变验证鉴定AnxA6 SUMO化位点。通过含有靶向AnxA6的shRNA的pLKO.1慢病毒转染HeLa细胞沉默AnxA6基因，而通过携带AnxA6或突变体AnxA6K299R质粒的Lenti-Vector在A431细胞中过表达AnxA6基因。此外，构建突变质粒pGFP-EGFRT790M/L858R以测试AnxA6对EGFR突变诱导的信号转导的调控。此外，通过CCK8、集落形成和伤口愈合实验评估AnxA6敲低或过表达后HeLa和A431细胞的增殖、迁移和吉非替尼化疗敏感性。并在上皮癌细胞异种移植裸鼠模型中测量体内致瘤性。结果：AnxA6明显被SUMO1在赖氨酸（K）残基上修饰，K299是上皮癌细胞中AnxA6的一个关键SUMO化位点。与野生型AnxA6相比，AnxA6敲低及其SUMO位点突变体AnxA6K299R在EGF刺激下对EGFR-ERK1/2去磷酸化的抑制作用较弱。SUMO化的AnxA6在EGF诱导下倾向于与EGFR结合，这促进了EGFR-PKCα复合物的形成，从而降低EGF诱导的EGFR-ERK1/2磷酸化和cyclin D1表达。同样，AnxA6 SUMO化抑制突变EGFR的去磷酸化，从而阻碍EGFR突变相关的信号转导。此外，AnxA6敲低或K299突变体AnxA6K299R使AnxA6失去抑制肿瘤进展的能力，导致上皮癌细胞对吉非替尼产生耐药性。在上皮癌细胞异种移植裸鼠模型中，来源于AnxA6敲低或AnxA6K299R突变表达细胞的肿瘤重量和大小远大于AnxA6表达细胞的肿瘤。结论：除了EGFR基因突变外，EGFR结合蛋白AnxA6的SUMO化修饰在介导上皮癌细胞生长和吉非替尼药物效应中也发挥关键作用。