体外HMGB1释放检测
验证EV71感染是否诱导HMGB1表达和释放。
使用HeLa和HT-29细胞感染EV71，在不同时间点检测HMGB1 mRNA和蛋白水平、细胞上清中HMGB1含量，并通过免疫荧光观察HMGB1的细胞定位。
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EV71感染诱导的HMGB1释放通过VE-cadherin磷酸化加剧血脑屏障破坏
HMGB1 Release Induced by EV71 Infection Exacerbates Blood-Brain Barrier Disruption via VE-cadherin Phosphorylation.
实验完整度
高包含体外细胞实验、体内小鼠模型及血管通透性功能验证和分子机制验证（VE-cadherin磷酸化）等多个独立证据层级。
主要模型
HeLa细胞 HT-29细胞 HCMECs单层BBB模型 AG6小鼠EV71感染模型
重点核对
HMGB1释放的体外模型：HeLa和HT-29细胞，MOI 0.3和1，时间点0-36 hpi 体外BBB模型：HCMECs单层培养于Transwell，EV71 3.12×10^6 PFU/孔，HMGB1蛋白1.25 μg/孔处理24 h 体内BBB模型：AG6小鼠，腹腔注射EV71 1.76×10^7 PFU/只和/或HMGB1蛋白5 μg/只，7天后检测 HMGB1中和实验：抗HMGB1中和抗体2.5 μg/mL处理，UV灭活病毒，检测通透性和VE-cadherin磷酸化
摘要
目的：EV71（肠道病毒71型）是手足口病（HFMD）暴发的主要病原体，其与血脑屏障（BBB）通透性破坏引起的神经损伤相关。HMGB1（高迁移率族蛋白B1）是一种广泛表达的核蛋白，可触发宿主炎症反应。本研究旨在探讨HMGB1在EV71感染中的作用及其对EV71相关BBB损伤的贡献。方法：使用HeLa细胞、HT-29细胞和AG6小鼠研究EV71感染中HMGB1的转位。使用重组HMGB1在HeLa细胞中研究释放的HMGB1对EV71复制和相关炎症因子的作用。使用重组HMGB1和抗HMGB1中和抗体在单层HCMECs（永生化人脑微血管内皮细胞）和AG6小鼠脑中探讨释放的HMGB1在EV71诱导的BBB损伤中的机制。结果：EV71在体内外诱导HMGB1核质转位和细胞外释放。释放的HMGB1作为EV71感染的炎症介质，而非影响病毒复制。释放的HMGB1通过增强HCMECs中VE-cadherin在酪氨酸685位的磷酸化，并降低EV71感染中HCMECs和AG6小鼠的总VE-cadherin水平，从而破坏BBB完整性。释放的HMGB1还可诱导活化星形胶质细胞增加。中和HMGB1可逆转HCMECs中内皮高通透性和VE-cadherin磷酸化的增加。结论：EV71释放的炎症介质HMGB1通过增强VE-cadherin磷酸化加剧BBB破坏，进而加重EV71诱导的神经炎症。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- EV71感染是否诱导HMGB1释放，以及释放的HMGB1如何影响血脑屏障完整性和神经炎症？
- 核心机制
- EV71感染诱导HMGB1核质转位和释放，释放的HMGB1通过增强VE-cadherin酪氨酸685位磷酸化并降低总VE-cadherin水平，破坏BBB完整性，加剧神经炎症。
- 主要证据
- 体外实验显示EV71感染诱导HMGB1释放，重组HMGB1增强HCMECs单层通透性并增加VE-cadherin磷酸化；体内实验显示AG6小鼠中EV71感染和HMGB1刺激增加脑BBB通透性和星形胶质细胞活化。
- 研究意义
- 该研究为EV71相关神经系统损伤的治疗提供了潜在靶点，未来可评估抗HMGB1中和抗体在保护BBB中的作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内HMGB1释放检测
在动物体内验证EV71感染是否诱导HMGB1释放。
AG6小鼠腹腔注射EV71（1.76×10^7 PFU/只），于4天处死，取小肠和血清，通过免疫荧光和ELISA检测HMGB1。
HMGB1对病毒复制及炎症因子的影响
评估释放的HMGB1是否影响EV71复制及其促炎作用。
在EV71感染过程中加入重组HMGB1（50或500 ng/mL），检测病毒蛋白水平（VP1）和炎症因子（IL-6、IL-8）的表达。
体外BBB模型评估通透性
评估HMGB1对EV71诱导的BBB通透性的影响。
在HCMECs单层Transwell模型中，加入EV71或重组HMGB1，或使用含HMGB1的条件培养基（中和抗体处理后），检测荧光素钠渗漏。
体内BBB模型评估通透性
在动物水平验证HMGB1对BBB通透性的影响。
AG6小鼠感染EV71并用HMGB1蛋白刺激，7天后通过伊文思蓝渗漏评估BBB通透性，并检测脑组织中的星形胶质细胞和小胶质细胞活化。
VE-cadherin磷酸化及表达检测
阐明HMGB1破坏BBB的分子机制。
在HCMECs和AG6小鼠脑组织中，检测VE-cadherin总蛋白及磷酸化（Tyr685）水平，以及中和HMGB1后的变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证免疫效应
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | HyClone | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 内皮细胞培养基 | ScienCell Research Laboratories | #1001 | |
| RNA提取和qPCR | TRIzol试剂 | Life Technologies | -- |
| PrimeScript RT试剂盒 | TaKaRa | -- | |
| SYBR Green qPCR预混液 | Vazyme biotech | -- | |
| Applied Biosystems 7500系统 | Applied Biosystems | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Santa Cruz | sc-364162A |
| 磷酸酶抑制剂 | Beyotime | -- | |
| BCA蛋白检测试剂盒 | Pierce, Thermo | -- | |
| SDS-PAGE凝胶电泳 | BIO-RAD | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| IRDye 800山羊抗鼠IgG | LI-COR Bioscience | -- | |
| IRDye 680驴抗兔IgG | LI-COR Bioscience | -- | |
| Odyssey红外成像系统 | LI-COR Bioscience | -- | |
| ELISA | HMGB1检测ELISA试剂盒 | Chondrex | 6010 |
| 小鼠HMGB1 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0676c | |
| Luminex多重蛋白阵列 | BIO-RAD | -- | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | -- | -- |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| Alexa Fluro 594标记驴抗兔IgG | -- | -- | |
| Alexa Fluro 488标记山羊抗鼠IgG | -- | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| Olympus FV3000共聚焦显微镜 | Olympus | -- | |
| 细胞活力 | CCK-8试剂盒 | Invigentech | -- |
| 体外BBB模型 | Costar Transwell插入式培养皿 | Corning | CLS3413 |
| 胶原蛋白 | -- | -- | |
| HMGB1重组蛋白 | Sino Biological | 10326-H08H | |
| 荧光素钠盐 | -- | -- | |
| HMGB1中和实验 | 抗HMGB1中和抗体 | arigo Biolaboratories | SQab20175 |
| 对照IgG抗体 | arigo Biolaboratories | ARG65345 | |
| 体内BBB模型 | 伊文思蓝 | -- | -- |
| 甲酰胺 | Invitrogen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与病毒感染 | HeLa、HT-29、Vero、HCMECs细胞系来源及培养条件；EV71毒株（BrCr）和病毒扩增方法 阅读提示：Methods 2.1 Cells and virus |
| HMGB1释放检测 | 感染复数（MOI）、感染时间点、细胞上清收集时间和ELISA检测方法 阅读提示：Results 3.1 和 Figure 1 图注 |
| 体外BBB通透性检测 | HCMECs单层培养条件、EV71和HMGB1处理浓度、通透性检测的荧光素钠浓度和时间 阅读提示：Methods 2.7 In vitro BBB model 和 Figure 4 图注 |
| HMGB1中和实验 | 抗HMGB1中和抗体浓度、UV处理条件、条件培养基加入量 阅读提示：Methods 2.8 In vitro HMGB1 neutralization BBB model 和 Figure 4C |
| 体内动物模型 | AG6小鼠周龄、EV71和HMGB1注射剂量、注射途径、取材时间点 阅读提示：Methods 2.10 和 2.11，Figure 2A 和 4F |