玻璃盖玻片和PDMS凝胶的制备
为E-钙粘蛋白包被提供基底。
清洗玻璃盖玻片；制备PDMS凝胶，混合CY-52-276 A和B，旋涂，固化，硅烷化，嵌入荧光纳米珠，钝化。
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在E-钙粘蛋白包被的玻璃或PDMS基底上进行上皮细胞铺展实验，用于基于显微镜的钙粘蛋白黏附分析
Epithelial cell spreading assay on E-cadherin-coated glass or PDMS substrates for microscopy-based analysis of cadherin adhesions.
实验完整度
中提供详细的实验方法步骤，包括基底制备、细胞铺展、免疫荧光和牵引力显微镜，但缺少完整的实验结果验证，主要依赖参考文献。
主要模型
MCF7细胞 MCF7 LifeAct-GFP细胞 E-钙粘蛋白包被的玻璃基底 E-钙粘蛋白包被的PDMS凝胶
重点核对
MCF7细胞在E-钙粘蛋白包被基底上铺展，需验证FBS浓度对铺展效率的影响 E-钙粘蛋白包被的均匀性，需通过免疫荧光验证 使用RGD肽抑制整合素介导的黏附 细胞铺展时间通常在2小时内，但需细胞类型依赖性验证
摘要
黏附连接（AJ）是多蛋白黏附结构，将组织内上皮细胞的收缩性肌动球蛋白网络耦联起来。在此，我们提出一种在E-钙粘蛋白包被的玻璃或聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底上进行上皮细胞铺展实验的方法，用于基于显微镜的钙粘蛋白黏附的详细分析。我们描述了玻璃盖玻片和PDMS凝胶的制备、E-钙粘蛋白包被以及上皮细胞铺展的步骤。上皮细胞可接种在E-钙粘蛋白包被的表面上，从而在X-Y维度上模拟AJ的形成，使其适用于显微镜分析。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何制备E-钙粘蛋白包被的玻璃和PDMS基底，并利用上皮细胞铺展实验分析钙粘蛋白黏附的形成和机制？
- 核心机制
- E-钙粘蛋白包被的基底模拟了黏附连接的形成，支持钙粘蛋白-连环蛋白复合物的组装和肌动蛋白流的力传递。
- 主要证据
- 通过免疫荧光染色和STED超分辨显微镜观察E-钙粘蛋白纳米簇的形成，以及通过牵引力显微镜检测力传递。
- 研究意义
- 该方案为研究黏附连接形成和稳定性的分子机制提供了工具。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
E-钙粘蛋白包被
在基底上固定E-钙粘蛋白配体，以支持细胞黏附。
将Protein A和hE-cadherin/Fc依次包被在玻璃或PDMS基底上，并用BSA封闭。
上皮细胞铺展实验
在E-钙粘蛋白包被的基底上铺展细胞，模拟黏附连接形成。
MCF7细胞经胰蛋白酶消化后重悬于movie media，接种于包被基底上，监测铺展。
免疫荧光和STED成像验证
验证E-钙粘蛋白纳米簇的形成和功能。
对铺展细胞进行免疫荧光染色，使用共聚焦和STED显微镜成像。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 玻璃盖玻片清洗 | 盐酸 | -- | -- |
| 乙醇 | -- | -- | |
| PDMS凝胶制备 | CY-52-276 A组分 | Dow Corning Toray | CY |
| CY-52-276 B组分 | Dow Corning Toray | CY | |
| PDMS凝胶硅烷化 | 3-氨丙基三甲氧基硅烷 | Sigma-Aldrich | 281778 |
| PDMS凝胶包被 | 羧基荧光纳米珠 | Thermo Fisher Scientific | 80469 |
| E-钙粘蛋白包被 | 蛋白A | Thermo Fisher Scientific | 21181 |
| 人E-钙粘蛋白/Fc融合蛋白 | Sino Biological | 10204-H02H | |
| 细胞铺展 | 胰蛋白酶-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 |
| 电影培养基 | -- | -- | |
| 显微镜成像 | Dragonfly旋转盘倒置共聚焦显微镜 | Andor | -- |
| DMi8倒置共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| Axio Imager正置宽场显微镜 | Zeiss | -- | |
| 小鼠抗β-连环蛋白抗体 | BD Biosciences | c19220 | |
| 兔抗E-钙粘蛋白胞质尾抗体 | Made by Alpha Yap Lab | -- | |
| 大鼠抗E-钙粘蛋白胞外域抗体 | Thermo Fisher Scientific | 13-1900 | |
| 山羊抗小鼠Alexa Fluor 488抗体 | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| 山羊抗兔Alexa Fluor 594抗体 | Thermo Fisher Scientific | A-11037 | |
| 山羊抗大鼠Alexa Fluor 647抗体 | Thermo Fisher Scientific | A-21247 | |
| 细胞铺展 | RGD肽 | Sigma-Aldrich | A8052 |
| 细胞培养 | MCF7细胞系 | ATCC | HTB-22 |
| MCF7 LifeAct-GFP细胞系 | -- | -- | |
| 显微镜成像 | 鬼笔环肽 | -- | -- |
| DAPI | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 玻璃盖玻片清洗 | HCl浓度、乙醇浓度、孵育时间、干燥条件 阅读提示：Before you begin, step 1 |
| PDMS凝胶制备 | CY-52-276 A/B比例、旋涂速度和时间、固化温度和时间、硅烷化试剂浓度、纳米珠浓度和孵育时间 阅读提示：Step-by-step method details, steps 1-16 |
| E-钙粘蛋白包被 | Protein A浓度和孵育时间、hE-cadherin/Fc浓度和孵育时间、BSA浓度和孵育时间 阅读提示：Step-by-step method details, steps 17-28 |
| 细胞铺展实验 | 细胞类型、胰蛋白酶处理时间、movie media组成、细胞接种密度、铺展时间 阅读提示：Before you begin, step 2; Step-by-step method details, steps 29-38 |
| 免疫荧光 | 抗体类型、稀释比例、固定和透化条件 阅读提示：Figure legends 3 and 4, Expected outcomes |