VHH抗体发现
获得靶向IL-18Rα和IL-18Rβ的特异性单域抗体
免疫骆驼科动物，构建YSD文库，通过两轮分选富集抗原结合克隆，对阳性克隆测序并选择VHH。
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基于单域抗体的强效双特异性IL-18模拟物的生成与工程化，且对IL-18BP诱饵受体抑制具有抗性
Generation and engineering of potent single domain antibody-based bispecific IL-18 mimetics resistant to IL-18BP decoy receptor inhibition.
实验完整度
高实验涵盖抗体发现、体外表征、功能验证和机制研究，包括YSD筛选、报告细胞实验、PBMC功能实验、IL-18BP抑制实验及格式工程化，证据层级完整。
主要模型
HEK-Blue™ IL-18 reporter cells 人外周血单个核细胞（PBMC） 骆驼科动物免疫模型
重点核对
YSD筛选使用250 nM的IL-18Rα和IL-18Rβ抗原浓度 HEK-Blue报告细胞实验中bsAbs浓度为50 nM，滴定范围100 nM至51.2 fM PBMC IFN-γ释放实验中，初始筛选使用100 nM bsAbs和1 nM rh IL-18，低剂量IL-12为10 ng/mL IL-18BP抑制实验中，IL-18和模拟物浓度固定为0.5 nM，IL-18BP浓度范围10 fM至100 nM TOP4候选物亲和力测量：IL18R_VHHα2β15对IL-18Rα的KD为5.2 nM，对IL-18Rβ的KD为12.8 nM
摘要
在此，我们生成了基于单域抗体（sdAbs）的双特异性抗体（bsAb）衍生物，这些衍生物模拟白细胞介素-18（IL-18）的功能，这些sdAbs特异性针对IL-18Rα和IL-18Rβ。为此，对骆驼科动物进行免疫，随后通过酵母表面展示（YSD）技术发现靶向各受体亚基的VHH。在将其重新格式化为严格单价（1+1）的双特异性sdAb架构后，几种bsAb在IL-18报告细胞上触发了剂量依赖性的IL-18R下游信号传导，以及在外周血单个核细胞存在低剂量IL-12的情况下触发IFN-γ释放。然而，与IL-18相比，其效力和效能显著减弱。通过工程化设计架构中的paratope价数以及各个paratope的空间方向，我们能够生成展现出显著增强功能性的IL-18模拟物，从而产生在触发促炎细胞因子释放方面比IL-18更有效的双特异性细胞因子模拟物。此外，所生成的IL-18模拟物不受IL-18结合蛋白诱饵受体抑制的影响。本质上，我们证明了该策略能够生成具有定制细胞因子功能的IL-18模拟物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何通过工程化单域抗体生成IL-18模拟物，并使其具备IL-18受体激动活性且不受IL-18BP抑制？
- 核心机制
- 通过靶向IL-18Rα和IL-18Rβ的单域抗体交联受体亚基，激活下游信号，且不结合IL-18BP；同时，paratope的价数和空间方向影响激动活性。
- 主要证据
- YSD筛选获得VHH，组合成双特异性抗体；HEK-Blue报告细胞显示激活NFκB；PBMC实验显示IFN-γ释放；BLI显示无IL-18BP结合；格式工程化增强效力。
- 研究意义
- 该策略可生成具有定制化细胞因子功能的IL-18模拟物，为抗肿瘤免疫治疗提供潜在替代方案。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
双特异性抗体构建与筛选
鉴定能够激活IL-18受体的双特异性抗体
将10个抗IL-18Rα和10个抗IL-18Rβ的VHH组合成100个SEED格式双特异性抗体，经SEC筛选后，在HEK-Blue报告细胞中测试NFκB激活。
PBMC功能验证
评估双特异性抗体在生理环境中诱导IFN-γ产生的能力
刺激人PBMCs，检测IFN-γ释放，筛选出初步候选分子。
格式工程化优化
通过调整paratope价数和空间方向来增强模拟物的功能
构建串联VHH和sdIgG格式，比较不同格式的IFN-γ诱导能力和生物物理特性。
IL-18BP抗性验证
验证生成的IL-18模拟物是否不受IL-18BP诱饵受体抑制
通过BLI检测模拟物与IL-18BP的结合，并在PBMC实验中测试IL-18BP存在下的功能。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
结合动力学分析
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抗体表达 | Expi293表达系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| ExpiCHO表达系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 抗体纯化 | MabSelect亲和层析介质 | GE Healthcare | -- |
| HiTrap MabSelect SuRe层析柱 | GE Healthcare | -- | |
| 抗体分析 | TSKgel UP-SW3000色谱柱 | Tosoh Bioscience | -- |
| 分析设备 | 安捷伦1260 Infinity高效液相色谱系统 | Agilent | -- |
| Octet RED96 生物层干涉仪 | ForteBio | -- | |
| 热稳定性分析 | Prometheus NT.PLEX nanoDSF 差示扫描荧光仪 | NanoTemper | -- |
| 细胞培养 | AIM V培养基 | Gibco | -- |
| 细胞分离 | SepMate-50分离管 | StemCell Technologies | -- |
| Lymphoprep淋巴细胞分离液 | StemCell Technologies | -- | |
| 细胞处理 | QUANTI-Blue检测试剂 | InvivoGen | -- |
| 细胞因子检测 | HTRF试剂盒 | Cisbio | -- |
| 检测分析设备 | PHERAstar FSX多功能酶标仪 | BMG Labtech | -- |
| Synergy HTX多功能微孔板检测仪 | BioTek | -- | |
| 生物素化试剂 | EZ-Link Sulf-NHS-生物素试剂 | Thermo Fisher | -- |
| 分析耗材 | AHC生物传感器 | ForteBio | -- |
| HIS1K生物传感器 | ForteBio | -- | |
| SA（链霉亲和素）生物传感器 | ForteBio | -- | |
| 实验试剂 | 完全弗氏佐剂 | -- | -- |
| 不完全弗氏佐剂 | -- | -- | |
| 蛋白表达 | ExpiFectamine CHO增强剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| ExpiCHO Feed培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| pTT5表达载体 | -- | -- | |
| 细胞培养 | YPD培养基 | -- | -- |
| SD基础培养基 | Takara Bio | -- | |
| SG基础培养基 | Takara Bio | -- | |
| 细胞分选 | BD FACSAria Fusion流式细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
| Alexa Fluor 488标记的抗HA抗体 | R&D Systems | IC6875G | |
| Penta His Alexa Fluor 647偶联物 | Qiagen | 35370 | |
| 别藻蓝蛋白标记的抗His标签抗体 | BioLegend | J095G46 | |
| 动物免疫 | IL-18Rα胞外域Fc融合蛋白 | R&D Systems | 816-LR |
| IL-18Rβ胞外域His标签蛋白 | Sino Biologics | 10176-H08H | |
| YSD分选 | IL-18Rα His标签蛋白 | Sino Biological | 11102-H08H |
| IL-18Rβ His标签蛋白 | Sino Biological | 10176-H08H | |
| 细胞刺激 | 重组人IL-18 | R&D Systems | -- |
| 重组人IL-12 | R&D Systems | -- | |
| IL-18BP抑制实验 | IL-18BP His标签蛋白 | Acro Biosystems | -- |
| IL-18BPa Fc嵌合体 | R&D Systems | -- | |
| 细胞培养 | 青霉素-链霉素 | Gibco | -- |
| 缓冲液 | 磷酸盐缓冲液 | -- | -- |
| 吐温-20 | -- | -- | |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| VHH发现 | 免疫剂量：200 μg；免疫时间：第0、14、24、35天；YSD分选抗原浓度250 nM 阅读提示：Camelid immunization; Library sorting |
| 双特异性抗体构建与筛选 | 质粒比例：AG:GA = 2:1；SEC纯度阈值>86% 阅读提示：Protein expression, purification, and analytics; Figure 2 |
| 报告细胞功能验证 | 细胞密度：5×10^4细胞/孔；刺激浓度：50 nM；孵育时间：24小时 阅读提示：Human IL-18 HEK reporter assay |
| PBMC功能验证 | PBMC密度：1×10^6细胞/孔；低剂量IL-12：10 ng/mL；初始筛选浓度：bsAbs 100 nM，IL-18 1 nM 阅读提示：IFN-γ release assay; Figure 3 |
| 格式工程化优化 | 表达系统：ExpiCHO (Max Titer Protocol)，250 mL规模；培养周期：11天；温度变化：36.5°C至32.0°C 阅读提示：Protein expression, purification, and analytics; Table 2 |
| IL-18BP抗性验证 | BLI：IL-18BP加载，模拟物浓度1000 nM；PBMC：模拟物和IL-18浓度0.5 nM，IL-18BP浓度范围10 fM至100 nM 阅读提示：Biolayer interferometry; IFN-γ release assay; Figure 4 |