相互作用组鉴定
鉴定与CCHFV Gn/Gc相互作用的宿主蛋白
在HEK293T细胞中表达带twin-Strep标签的Gn或Gc（在GPC背景下），通过Strep-tag亲和纯化，结合定量质谱分析，鉴定高置信度相互作用蛋白。
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克里米亚-刚果出血热病毒糖蛋白的相互作用组分析
Interactome profiling of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus glycoproteins.
实验完整度
高包含AP-MS/MS相互作用组鉴定、pull-down验证、亚细胞定位分析、假病毒和活病毒实验、CRISPR-Cas9基因敲除以及小鼠模型等多个独立证据层级，并进行功能与机制验证。
主要模型
HEK293T细胞 Huh7细胞 HeLa细胞 C57BL/6小鼠模型
重点核对
AP-MS/MS实验使用HEK293T细胞，转染含twin-Strep标签的Gn或Gc的GPC表达质粒，36小时后裂解并纯化，设4个生物学重复。 HAX1与Gn的相互作用通过Strep-pulldown和S-pulldown验证，并使用HEK293T和Huh7细胞，在36小时收样检测。 HAX1对假病毒包装的影响实验中，CCHFV假病毒（VSV△G/GFP-CG）在HEK293T细胞中产生，并检测GFP阳性细胞，设3个生物学重复。 HAX1过表达实验中，Huh7细胞感染CCHFV（MOI=0.1），检测病毒蛋白、RNA、基因组拷贝和病毒滴度，设3个生物学重复。 小鼠实验中，6-8周龄雌性C57BL/6小鼠（n=4）转导shRNA慢病毒（1×10^7 TU），一周后感染CCHFV（1.5×10^6 TCID50），3天后检测器官病毒载量。
摘要
克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）是一种生物安全四级病原体，迫切需要研究和开发工作。CCHFV的糖蛋白Gn和Gc被认为通过与宿主细胞的相互作用在病毒生命周期中发挥多种作用；然而，这些相互作用至今仍 largely 不清楚。在这里，我们分析了CCHFV糖蛋白的细胞相互作用组，并鉴定了45个宿主蛋白作为高置信度的Gn/Gc相互作用因子。这些宿主分子参与多种细胞生物学过程，可能与病毒糖蛋白的生理作用相关。然后，我们阐明了一个代表性细胞蛋白HAX1的作用。HAX1通过其C端与Gn相互作用，而其N端区域导致线粒体定位。通过强相互作用，HAX1将Gn隔离到线粒体，从而剥夺了Gn的正常高尔基体定位，这是功能性糖蛋白介导的子代病毒粒子包装所必需的。一致地，HAX1对病毒包装及因此传播的抑制活性在假型和真实CCHFV感染的细胞和动物模型中得到进一步阐明。总之，这些发现提供了系统的CCHFV Gn/Gc-细胞蛋白-蛋白相互作用图谱，并揭示了HAX1/线粒体相关的宿主抗病毒机制，这可能促进CCHFV生物学和治疗方法的进一步研究。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CCHFV糖蛋白Gn/Gc与宿主细胞的相互作用网络以及代表性宿主因子在病毒感染中的功能与机制是什么？
- 核心机制
- HAX1通过其C端与Gn结合，并依赖N端线粒体定位，将Gn隔离到线粒体，从而扰乱Gn的高尔基体定位，抑制病毒包装和子代病毒的产生。
- 主要证据
- AP-MS/MS鉴定45个高置信度相互作用蛋白；Strep-pulldown和S-pulldown验证HAX1与Gn/Gc相互作用；共聚焦显微镜显示Gn被HAX1重新定位至线粒体；假病毒实验证明HAX1抑制包装但不影响入侵；活病毒实验显示HAX1过表达抑制、敲低或敲除增强CCHFV感染；小鼠模型中HAX1敲低增加器官病毒载量。
- 研究意义
- 研究提供了CCHFV Gn/Gc-宿主蛋白相互作用图谱，并揭示HAX1/线粒体相关抗病毒机制，为理解CCHFV生物学和开发治疗策略提供基础，可能有助于病毒扩增和动物模型开发。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
相互作用验证
验证质谱鉴定到的代表性相互作用蛋白与Gn/Gc的结合
通过Strep-pulldown和S-pulldown实验，在HEK293T和Huh7细胞中验证候选蛋白（包括HAX1）与Gn/Gc的相互作用，并通过Western blot检测。
亚细胞定位分析
研究HAX1对Gn/Gc亚细胞定位的影响
通过免疫荧光和共聚焦显微镜，在HeLa细胞中观察Gn/Gc与HAX1的共定位，以及HAX1对Gn高尔基体定位和线粒体定位的影响。
HAX1结构域功能分析
确定HAX1中与Gn相互作用和线粒体定位所需的结构域
构建HAX1截短突变体，通过pulldown和免疫荧光分析各突变体与Gn的结合能力及对Gn线粒体定位的影响。
功能验证
评估HAX1对CCHFV糖蛋白介导的入侵和包装的影响
使用表达CCHFV糖蛋白的VSV假病毒系统（VSV△G/GFP-CG），检测HAX1过表达对假病毒入侵和包装的影响。
活病毒验证
验证HAX1对CCHFV感染和复制的影响
在细胞模型中，通过HAX1过表达、RNAi敲低和CRISPR-Cas9敲除，检测CCHFV感染后的病毒蛋白、RNA、基因组拷贝和病毒滴度变化。
体内验证
评估HAX1在动物体内对CCHFV感染的影响
通过尾静脉注射表达HAX1靶向shRNA的慢病毒载体建立小鼠HAX1敲低模型，感染CCHFV后检测器官病毒载量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
功能验证
基因敲低/敲除
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| Eagle最低必需培养基 | -- | -- | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 细胞活性检测 | 细胞计数试剂盒-8 | MedChemExpress | HY-K0301 |
| 蛋白质纯化 | MagStrep XT磁珠 | IBA Life Sciences | 2-4090-002 |
| S蛋白琼脂糖 | Millipore | 69704 | |
| Complete蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 04693132001 | |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | L3000015 |
| SuperSignal West Pico化学发光底物 | Thermo Scientific | 34580 | |
| 抗Gc小鼠单克隆抗体 | -- | -- | |
| 抗Gn小鼠或兔多克隆抗体 | -- | -- | |
| 抗S-tag抗体 | Sino Biological | 101290-T38 | |
| 抗Strep-tag抗体 | Sangon Biotech | D191106 | |
| 抗HAX1抗体 | Proteintech | 11266-1-AP | |
| 抗KPNB1抗体 | ABclonal | A8610 | |
| 抗RPN1抗体 | Abcam | ab198508 | |
| 抗HADHA抗体 | ABclonal | A13310 | |
| 抗THBS4抗体 | ABclonal | A16438 | |
| 抗ATP1A1抗体 | ABclonal | A7878 | |
| 抗COXIV抗体 | Proteintech | 11242-1-AP | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| 抗β-actin抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG | Proteintech | SA00001-1 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Proteintech | SA00001-2 | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor-488标记的山羊抗小鼠IgG | Abcam | ab150113 |
| Alexa Fluor-555标记的山羊抗小鼠IgG | Abcam | ab150114 | |
| Alexa Fluor-647标记的山羊抗兔IgG | Abcam | ab150079 | |
| Hoechst 33258染料 | Beyotime | C1011 | |
| MitoTracker红色CMXRos探针 | Thermo Fisher Scientific | M7512 | |
| 线粒体分离 | 细胞线粒体分离试剂盒 | MedChemExpress | HY-K1060 |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| RT-qPCR | PrimeScript反转录试剂盒（含gDNA Eraser） | Takara | 047A |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara | 820A | |
| StepOnePlus实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 病毒RNA提取 | MiniBEST病毒RNA/DNA提取试剂盒 | Takara | 9766 |
| 病毒RNA检测 | One Step PrimeScript T-PCR试剂盒 | Takara | RR064A |
| CRISPR-Cas9 | pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) V2.0载体 | -- | -- |
| 嘌呤霉素 | Gibco | A1113803 | |
| 质谱分析 | TripleTOF 5600+质谱仪 | SCIEX | -- |
| nanoLC-Ultra 1D Plus纳升液相系统 | Eksigent | -- | |
| 流式细胞术 | BD LSRFortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 细胞培养 | Biotek Synergy H1酶标仪 | Biotek | -- |
| 显微镜 | Andor共聚焦显微镜（Dragonfly 202） | Andor | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| AP-MS/MS相互作用组鉴定 | 细胞类型（HEK293T）、质粒（pCAGGS-2Strep/Gn-Gc或pCAGGS-Gn-Gc/2Strep）、转染时间（36小时）、生物学重复数（4个）、质谱分析标准（FC>2且p<0.05） 阅读提示：方法中的“Strep-tag affinity purification and mass spectrometry analysis”部分及图1a |
| 蛋白质相互作用验证 | 细胞类型（HEK293T和Huh7）、转染时间（36小时）、Strep-pulldown和S-pulldown方法、抗体 阅读提示：方法中的“Strep-tag affinity purification”、“S-tag pulldown assay”和“Western blot analysis”部分及图2d-e |
| 亚细胞定位分析 | 细胞类型（HeLa）、转染时间（36小时）、标记方法（MitoTracker、B4GALT1-EGFP）、PCC统计 阅读提示：方法中的“Immunofluorescence assay”部分及图4b-c、图5a-d |
| HAX1结构域功能分析 | HAX1截短突变体（HAX1-N、HAX1-C1、HAX1-C2）、pulldown和IFA实验条件 阅读提示：图6a-c及相应方法 |
| 假病毒包装和入侵实验 | 细胞类型（HEK293T）、假病毒构建方法（VSV△G/GFP-CG）、HAX1过表达条件、感染时间（24小时）、GFP阳性细胞检测 阅读提示：方法中的“Analysis of CCHFV glycoprotein-mediated entry and packaging with pseudotyped viruses”部分及图7 |
| 活病毒感染实验 | 细胞类型（Huh7、HEK293）、感染MOI（0.1）、感染时间（48小时）、HAX1过表达/敲低/敲除方法、检测指标（病毒蛋白、RNA、病毒滴度） 阅读提示：方法中的“CCHFV infection of HAX1-KD mice”和“RNA extraction and real-time qPCR assay”部分及图8 |
| 体内实验 | 小鼠品系、周龄、性别（6-8周龄雌性C57BL/6）、每组数量（n=4）、慢病毒注射量（1×10^7 TU）、感染剂量（1.5×10^6 TCID50）、感染时间（3天）、检测组织 阅读提示：方法中的“CCHFV infection of HAX1-KD mice”部分及图8k-l |